人卵母细胞成熟过程中卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展

毛晓燕 综述， 丘 瑾 审校

(1. 同济大学附属第十人民医院妇产科，上海 200072； 2. 上海交通大学医学院附属同仁医院妇产科，上海 200050)

哺乳动物的卵母细胞与相邻的体细胞之间以相互依赖的方式生长发育。卵巢颗粒细胞是卵泡中围绕在卵母细胞周围的体细胞，当卵泡形成窦腔时，颗粒细胞会分化成两种解剖学和功能学不同的细胞谱系： 壁颗粒细胞(mural granulose cell, MGC),排列在毛囊壁上,主要功能是合成类固醇激素并促进卵泡壁破裂；卵丘细胞(cumulus cell, CC),卵丘细胞具有高度特异性的跨细胞质突起，其尖端通过透明带突出，通过间隙连接与卵母细胞膜直接接触，形成卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complex, COC)。一般而言，卵丘细胞负责收集细胞增殖与代谢相关的转录物，而颗粒细胞则负责细胞分化和信号转导相关的转录物。与颗粒细胞相比，卵丘细胞表现出更高的细胞增殖率，更高的抗缪勒氏激素(AMH)表达水平，并且具有分泌透明质酸用于卵丘扩展的高能力。

在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞发挥着重要的作用，主要包括以下三个方面： (1) 维持卵母细胞减数分裂停滞状态；(2) 帮助诱导减数分裂恢复；(3) 促进细胞质的成熟。卵丘细胞的上述关键作用归因于COC间精细的缝隙连接网络和它们之间特定的代谢能力。葡萄糖是COC的关键代谢物，通过糖酵解途径、磷酸戊糖途径(PPP)、己糖胺生物合成途径(HBP)和多元醇途径进行代谢。另一方面，卵母细胞通过分泌可溶性生长因子(OSF)作用于邻近的滤泡细胞，将旁分泌信号传导至卵丘细胞指导卵丘分化，从而调控自身的微环境，这也是近几年的研究热点。

1 卵母细胞成熟过程中的重要代谢途径

在卵母细胞成熟过程中，葡萄糖是COC的关键代谢物。无氧糖酵解是哺乳动物卵泡中葡萄糖代谢的主要途径，随着卵泡发生黄素化，葡萄糖消耗产生ATP或形成容易被卵母细胞利用的代谢物如丙酮酸、乳酸从而产生能量。然而，卵母细胞由于磷酸果糖激酶活性低，因而其葡萄糖代谢能力低。相反，卵丘细胞具有高糖分解活性，能将葡萄糖代谢成丙酮酸，在卵母细胞成熟过程中转移到卵母细胞作为能量来源。在卵母细胞内，丙酮酸在线粒体中转化为乙酰辅酶A(CoA)，后者进入三羧酸(TCA)循环和电子传递链产生ATP。卵母细胞又通过上调卵丘细胞中的糖酵解基因确保其自身递送丙酮酸。

磷酸戊糖途径(PPP)在卵母细胞成熟过程中也是重要的葡萄糖代谢途径，其可分为氧化阶段和非氧化阶段，葡萄糖可在任一阶段进入PPP。通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)将葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡糖酸内酯导致NADPH的产生，NADPH通过还原谷胱甘肽来保持细胞质的完整性和氧化还原状态。Cetica等发现，与牛卵丘细胞相比，卵母细胞具有相对较高的G6PDH(氧化阶段的限速酶)活性，暗示了卵母细胞中磷酸戊糖活性较卵丘细胞中高。

HBP主要用于细胞外基质(ECM)的合成，调控卵丘细胞扩展。HBP将葡萄糖-6-磷酸代谢成果糖-6-磷酸，其被葡糖胺(果糖-6-磷酸转氨酶GFPT)转化成葡糖胺-6-磷酸，最终生成UDP-N-乙酰葡糖胺。在卵丘细胞中，大多数UDP-N-乙酰葡糖胺将被透明质酸合成酶2(HAS2)转化为透明质酸。透明质酸是卵丘细胞来源的细胞外基质的主要结构骨架。Sato等研究发现透明质酸受体CD44 mRNA在猪卵丘细胞中表达，并且其表达随着卵丘扩展程度的增加而增加。此外，还发现在卵丘扩展期间，透明质酸受体CD44系统能激活一些成熟因子，导致卵母细胞的生发泡破裂以及连接蛋白43(Cx43)中酪氨酸磷酸化。研究表明，卵丘扩展的主要成分为透明质酸，透明质酸CD44系统将调节COC缝隙连接的破坏，同时控制猪卵母细胞减数分裂恢复的发生率。

多元醇途径则涉及醛糖还原酶(AR)和山梨醇脱氢酶(SDH)将葡萄糖氧化为山梨醇和果糖。在正常血糖条件下，多元醇途径占体细胞总葡萄糖代谢的非常少，主要是因为醛糖还原酶对葡萄糖具有较低的亲和力。Kaneko等发现醛糖还原酶(AR)在大鼠卵巢颗粒细胞和卵母细胞中表达，且山梨醇脱氢酶(SDH)在卵母细胞中高度表达。虽然卵丘细胞具有高水平的糖酵解活性以向卵母细胞提供用于氧化磷酸化的代谢物，但两种酶的定位表明卵巢颗粒细胞将葡萄糖转化为山梨糖醇，为卵母细胞提供用于能量生产的替代底物，即果糖。迄今为止，COC中的山梨糖醇和果糖水平仍尚未被测定。

2 卵母细胞成熟过程中的重要分泌因子

卵母细胞从根本上是依赖于卵丘细胞来执行多种功能。卵母细胞通过局部分泌强效生长因子(OSF)和表皮生长因子(EGF)来决定卵丘细胞的分化和作用，并且充当邻近滤泡细胞的中心调节器。OSF主要包括生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)，还包括骨形态发生蛋白6(BMP6)以及一些成纤维细胞生长因子(FGF)在内的其他成分。

生长因子参与的一些重要过程包括调节生殖细胞向性腺嵴迁移[10]，协助颗粒和/或卵丘细胞分化、增殖、凋亡和黄素化的调节以及卵泡生长速率的调节；还能促进卵母细胞代谢所需的卵丘细胞糖酵解，如BMP15和FGF8在小鼠卵丘细胞中能促进编码糖酵解酶的基因表达[11]；此外还包括协助COC识别排卵所需的卵丘细胞表皮生长因子(EGF)家族信号传导，控制排卵所需的卵丘扩展。研究发现，雌二醇(E2)和卵母细胞生长分化因子9(GDF9)及BMP15之间具有协调作用，雌二醇(E2)能促进卵丘细胞的发育并保持其扩展能力[12]。事实上，卵丘扩展是一个非常复杂的过程，需要从卵泡中选出最佳的卵丘-卵母细胞复合团。卵丘扩展的开始取决于两个关键信号事件： 促性腺激素或EGF样肽的刺激；卵母细胞产生的旁分泌信号，即位于卵丘细胞上的卵丘促进因子(CEEF)，使其能够响应促性腺激素/表皮生长因子(EGF)信号如透明质酸合成酶2(HAS2)、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(TNFαIP6)、正五聚蛋白3(PTX3)和前列腺素-过氧化物合成酶2(PTGS2)]以合成细胞外基质(ECM)分子。由于不能合成卵丘基质的成分会导致生育力降低或不育[13]，因此卵母细胞的排卵和卵丘扩展对于维持女性生育力都是绝对必要的。

在卵泡形成过程中，GDF9和BMP15作为转化生长因子TGF-β超家族的两个关系密切的成员，已被认为是卵泡发育所必需的。GDF9和BMP15能参与原始卵泡向初级卵泡进化，在卵泡发育和成熟的后期阶段均发挥了重要作用。GDF9缺陷的雌性小鼠，由于初级卵泡形成阻滞而不育，这表明卵母细胞产生的GDF9是原始卵泡到初级卵泡发育转变所必需的。更有趣的是，编码抑制素α(Inha)转录物的表达水平在GDF9缺陷型的小鼠卵巢中显著上调，并且在GDF9/Inha双重敲除的小鼠中未观察到初级卵泡形成受阻，这表明Inha的异常表达是导致GDF9缺陷型卵巢卵泡发育阻滞的主要原因[14]。而在BMP15基因敲除的雌性小鼠模型中则发现排卵和受精率均降低。在目前的临床研究中，已经发现GDF9和Bmp15基因突变与卵巢早衰有关以及GDF9的异常表达可能与多囊卵巢综合征也相关[15]。目前在卵巢早衰和/或多囊卵巢综合征的分子机制研究中，BMP15和GDF9已被认为是良好的候选基因，且这两种分泌蛋白已被确定为评估卵巢储备的潜在生物学标志物。在多囊卵巢综合征患者的卵巢中发现GDF9蛋白的表达水平相对较低，这可能导致卵巢过早黄体化，引起黄体功能障碍，进一步增加流产率。这些研究结果为卵母细胞生长分化因子在卵泡微环境中调节卵母细胞成熟提供了有力证据。

在结构上，GDF9和BMP15最具特征性的是这两个分子缺乏转化生长因子TGF-β超家族最常见的第四个半胱氨酸残基，使得它们无法形成二硫键稳定的二聚体，而是形成GDF9/BMP15异源二聚体。与同源二聚体不同的是，异源二聚体结合蛋白是细胞内SMAD途径(SMAD2/3和SMAD1/5/8)的有效激活剂，这可能是GDF9和BMP15发挥有效生物活性的主要原因[16]。SMAD是转化生长因子TGF-β超家族细胞内重要的信号转导和调节分子，可以将TGF-β信号直接由细胞膜转导至细胞核内。

近年来，已有研究显示GDF9和BMP15通过已知的TGF-β超家族受体发出信号以激活细胞内SMAD途径[17]。并且已有研究确定，通过卵母细胞激活颗粒/卵丘细胞中的SMAD2/3途径是调控颗粒/卵丘细胞功能的主要核心。TGF-β超家族成员通过不同组的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体(Ⅰ型和Ⅱ型受体)发出信号，其通过磷酸化SMAD转录因子(SMAD1-8)来进一步调节下游靶基因的表达。迄今为止，已经在哺乳动物中鉴定了7种Ⅰ型受体(也称为活化素受体样激酶；ALK1-7)和5种不同的Ⅱ型受体(BMPR2，ACVR2A，ACVR2B，TβR2和AMHR2)[18]。BMP15使用经典的BMP途径在颗粒细胞中发出信号，即BMP15结合BMP-Ⅱ型受体(BMPR2)和活化素受体样激酶6(ALK6)，进一步激活SMAD1/5/8细胞内途径。而GDF9则利用两种TGF-β超家族信号系统的杂交组合，即GDF9结合BMP-Ⅱ受体(BMPR2)，和利用TGF-βⅠ型受体活化素受体样激酶5(ALK5)，导致SMAD2/3信号通路的激活[19]。

3 卵母细胞成熟过程中的重要通讯结构

卵丘细胞和卵母细胞之间的相互作用除了上文概述的旁分泌信号因子，还存在一种不可或缺的关系，即： 缝隙连接。在女性卵泡发育的过程中，生长的卵母细胞正是通过缝隙连接与其周围的体细胞发生偶联。COC中的缝隙连接有助于卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育。缝隙连接是由六个连接蛋白(Cx)组成的一种跨膜蛋白结构，Cx家族有20多个成员。所有的连接蛋白均具有相同的基本结构，即4个跨膜结构域，两个胞外环，一个细胞质环和细胞质N-和C-末端。缝隙连接通常与亲水分子的转移有关，相对分子质量小于1000。使用放射性同位素与小鼠COC的典型实验发现，一系列分子能够穿越卵丘细胞的缝隙连接到卵母细胞[20]，特别是卵母细胞生长所必需的离子、核苷酸、氨基酸和控制卵母细胞核成熟的小分子，如环磷酸腺苷(cAMP)。缝隙连接允许小分子量分子在卵丘细胞和卵母细胞之间转移，从而促进卵丘细胞和卵母细胞之间的葡萄糖代谢物和离子的交换。

目前的研究认为，人卵丘-卵母细胞复合物中缝隙连接的主要贡献者是Cx43蛋白，它对于影响人卵母细胞的发育能力是至关重要的[21]。Cx43蛋白具有较长的胞质C-末端受到广泛的翻译后修饰，其能调节胞内运输和缝隙连接通道门控[22]。并且，已有研究表明缺乏Cx43蛋白的小鼠表现出胎儿性腺中生殖细胞数量减少，卵母细胞生长受阻导致卵泡发育停滞和受精失败。此外，Winterhager等[23]发现，连接蛋白43(Cx43)也在人的卵丘细胞中表达，在IVF情况下，该链接蛋白与女性妊娠结局相关，提示Cx43可能是评估女性卵母细胞和胚胎质量的决定因素之一。不仅如此，该研究还发现，在女性的胎盘中，Cx43是从细胞滋养层到合体滋养层融合途径的关键调节剂，发挥了促进胎盘生长的重要作用。有研究使用微阵列的方法证实了在卵丘细胞中不仅存在Cx43基因(GJA1)，还存在Cx37(GJA4)和Cx40(GJA5)等与缝隙连接有关的其他基因。目前认为在人类的生长滤泡中，连接蛋白43(Cx43)主要促成卵丘细胞/颗粒细胞之间缝隙连接的形成，而卵母细胞和周围卵丘细胞之间的缝隙连接则主要由连接蛋白37(Cx37)组成，敲除Cx37将导致卵母细胞和卵丘细胞之间的细胞间偶联破坏，卵泡发育受阻，抑制卵母细胞成熟和造成排卵功能障碍。因此Cx43和Cx37是与卵母细胞和卵丘细胞之间的缝隙连接通讯最为密切两个相关蛋白。

4 展 望

近年来，在生殖医学领域越来越多的研究者认识到卵母细胞质量是评估女性生育能力的一个关键因素[24]。众所周知，随着母体年龄的增加，卵母细胞支持早期胚胎发育的能力将逐步下降[25]。卵母细胞的质量反映在其内在发育潜力上，卵母细胞的成熟水平受到其与体细胞之间双向沟通的显著调控，这些细胞之间的分子运输能力将进一步改善卵母细胞代谢状态及调节成熟能力。优质的卵母细胞通过特异性生长因子调节自身的内环境，且进一步诱导细胞发育成熟并成功受精形成良好的胚胎。相反，卵母细胞质量不佳则会导致胚胎发育停滞或自然流产。目前，人们对卵母细胞-体细胞通讯轴的性质有了新的认识，卵母细胞在卵泡中不是被动的，而是充当体细胞分化和作用的基本调节因子，并且在卵泡发育过程中起到核心作用。研究卵母细胞质量的决定因素的一个重要意义是为了提高卵母细胞体外成熟(IVM)的临床实施，影响IVM妊娠率的一个关键因素即为卵母细胞质量，因此任何关于调节卵母细胞质量的新知识都可以用以帮助提高临床IVM的妊娠率，从而为改善和治疗不孕症带来新的希望。