抗DNA病毒信号通路cGAS-STING的研究进展

欧阳婷，刘晓慧，任林柱

(吉林大学动物科学学院，长春 130062)

固有免疫系统通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)检测病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，并触发I型干扰素和促炎细胞因子的相关信号通路[1]。研究发现，细胞检测病毒PAMPs的PRRs可以分为两类：一类是识别病毒RNA的PRRs，包括胞内Toll样受体家族(Toll-like receptors，TLRs)中的TLR3、TLR7、TLR8，以及胞质RIG-I样受体(RIG-I like receptors，RLRs)和黑色素瘤分化相关基因5蛋白(melanoma differentiation-associated gene-5，MDA5)等；另一类是识别病毒DNA的PRRs，常见的有TLR9、AIM2(absent in melanoma 2)、DNA结合蛋白(DNA-dependent activator of IRFs，DAI)、RNA聚合酶Ⅲ(RNA pol III)、干扰素诱导蛋白16(IFN-γ-inducible protein 16，IFI16/p204)、DDX41(DEAD-box helicase 41)等[2-3]。研究证实，在特定的细胞和老鼠模型中TLR9、AIM2、DAI、RNA聚合酶Ⅲ、IFI16、DDX41以及LSm14 A(mRNA processing body assembly factor)能够用于识别病毒DNA，但这些受体蛋白并不广泛适用于所有类型的细胞和体内的病毒DNA识别[4]。

2013年Gao等[5]在哺乳动物中发现了一种广泛存在于各种细胞的胞质DNA识别受体cyclic adenosine-adenosine synthase(cGAS)，该受体能够在识别病毒DNA后催化合成内源性第二信使分子——环化二核苷酸cGAMP(2’-3’ cyclic AMP-GMP)，随后激活靶定在内质网(endoplasmic reticulum，ER)上的干扰素刺激基因(stimulator of interferon genes，STING；也称为MITA、TMEM173)蛋白，进而触发I型干扰素的抗病毒反应[6]。STING是DNA识别信号通路中的重要接头蛋白，有研究表明，目前所发现的胞内双链DNA识别受体均可以通过STING蛋白介导激活I型干扰素通路[7]，对于固有免疫和适应性免疫反应具有重大的意义[8]。Lio等[9]发现CMV能激发cGAS-STING通路，同时发现STING缺失细胞中感染RNA病毒后，IFN的表达水平下降，表明了cGAS-STING通路在抗病毒免疫反应中占据重要地位。鉴于此，本文综述了cGAS-STING通路在抗病毒免疫反应中的作用。

1 cGAS识别DNA

cGAS是核酸转移酶家族中的一员，其晶体结构与2’-5’-寡腺苷酸合成酶(2’-5’-oligoadenylate synthase 1，OAS1)高度相似[10]。OAS1能特异性识别双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，而cGAS主要识别双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)[11]。cGAS包含一个核酸转移酶区域和两个主要的DNA结合位点[10, 12-13]。两个DNA结合位点对复合体的形成发挥作用，其中，位点一在cGAS活化构象改变中发挥作用，而位点二在cGAS二聚体形成过程中起辅助作用[8, 10, 12]。静息状态下，cGAS结合DNA形成2: 2的复合体，引起cGAS构象的改变从而转变为活化状态，并催化ATP和GTP生成环化二聚核酸化合物cGAMP[10]。晶体学研究表明，cGAS的C端存在一个高度保守的锌指结构，该锌指结构和cGAS表面的正电荷有助于cGAS结合DNA，并借助Mg2+和Mn2+的作用使cGAS构象改变，进而催化形成cGAMP[14]。此外cGAS与DNA的结合主要发生在DNA的核糖-磷酸骨架上，因此cGAS与DNA的结合不需要依赖序列的特异性[10]。Li等在研究dsDNA长度与cGAS活化之间的作用时发现，当dsDNA的长度为12 bp时不能有效地活化cGAS，而当长度为18 bp时cGAS的活性达到了90%，这是因为dsDNA的长度大于16 bp才能与cGAS二聚体的两个DNA识别位点结合，促使构象改变从而活化cGAS[10, 14]。

近期研究发现，cGAS也能与单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)结合形成二聚体结构从而激活cGAS，其中，一些由ssDNAs形成的Y型结构中包含一个双链体和含鸟嘌呤残基的单链突出端，该鸟嘌呤残基对活化cGAS起作用，但Y型结构对活化cGAS的相关作用需要进一步的验证[15]。此外，dsRNA也能与cGAS结合，但并不能激活cGAS。建模研究表明，B型DNA结合并推动cGAS的活化环，使cGAS的活化位点发生重排进而活化。相比之下，A型的dsRNA不能使活化位点发生重排，因此dsRNA不能激活cGAS[15]。

2 cGAMP激动STING蛋白诱导产生Ⅰ型干扰素

2008年，两个研究组分别从人或鼠的cDNA表达文库中筛选出可激活干扰素调节因子3(IFN regulatory factor 3，IRF3)的基因，其编码蛋白分别命名为STING和MITA(mediator of IRF3 activation)，随后的研究证实STING和MITA为同一个蛋白[16]。

STING蛋白是诱导产生I型干扰素过程中重要的接头蛋白，主要位于内质网和线粒体上。STING在多种免疫组织细胞，如胸腺、心脏、脾、胎盘、肺以及外周血白细胞等，中高水平表达；而在脑部、骨骼肌、结肠、小肠、肝及肾等组织器官中表达量较低；同时，该基因在个别改造过的细胞系中的表达水平也较高，如HEK293肾胚胎细胞、A549肺癌细胞、THP-1单核细胞、U937淋巴瘤细胞等[17]。

序列比对发现，人源STING基因编码379个氨基酸，与鼠源STING基因的相似度高达81%[17]。STING蛋白的C端结构域CTD(C-terminal helicase domain)位于细胞质中，N端含有多个跨膜(transmembrane，TM)结构域[16, 18]。多位研究者都认为STING含有4个TM结构域：Zhong等发现STING的第3个TM将STING定位于线粒体[19-20]；Jin等[21]发现少量的TM结构域也可定位于质膜上；Sun等[22]发现STING蛋白定位于内质网上，蛋白中间存在两个内质网滞留序列(分别为R76Y77R78和R178I179R180)；而Ishikawa等[23]认为STING有5个TM结构域，静息状态下STING主要定位于内质网上，且在内质网和线粒体相邻的区域MAMs(mitochondria-associated membranes)上也有分布。晶体结构研究发现，人源STING的CTD由138～379位氨基酸组成，分别为由152～173位氨基酸组成的二聚结构域(dimerization domain，DD)和C端结构(C-terminal tail，CTT)，其中DD区域为高度保守的疏水结构域[11]，无配体的情况下STING蛋白多为二聚体的形式存在，且蛋白在DD区域发生聚合，STING蛋白二聚化是产生干扰素的关键因素[17]。

目前，对于STING蛋白的活化有两种说法：一种是STING蛋白二聚体处于自我抑制的状态，cGAMP或其它二核糖核酸类化合物通过疏水作用和氢键结合到STING蛋白二聚体的裂缝中，导致STING蛋白构象改变、活化并释放出CTT结构域，活化后的STING蛋白招募和激活TANK-结合激酶1(TANK-binding kinase 1，TBK1)[15]，然而，CTT结构域在STING的晶体结构中并不是显而易见的。分子模型和功能实验分析发现，STING与cGAMP结合形成一个帽子结构，并提供了一个与STING的羧基末端结合的锚定位点，这使得CTT形成一个类似于TBK1底物的结构，而被TBK1磷酸化，进而引起IRF3的活化[15]。另一种说法是，STING感应胞质中的dsDNA后，促使其二聚化，并出现胞质离散灶的重新定位，这种重定位有助于招募和激活TBK1，进而磷酸化IRF3[17]。研究表明，活化的STING可定位于核外周并形成点状结构，而未活化的则定位于内质网与线粒体上[22]。活化的STING与招募来的TBK1和IRF3一起靠近核外周，同时激活IKK(inhibitor of NF-κB kinase)、促进NF-κB(nuclear factor κB)磷酸化[24]。磷酸化的IRF3在此过程中聚合形成二聚体并和NF-κB一起转移至细胞核中激活干扰素基因和其它细胞因子的转录，从而产生免疫应答，发挥抗病毒作用[12]。

此外，研究证实，STING能够通过其CTD结构域直接识别细胞质中c-di-GMP和c-di-AMP[25]。Paludan等[25]认为CTD结构域有助于促进STING二聚化，环二核苷酸结合主要发生在STING二聚体中的裂缝中，并有利于缓解STING的自我抑制状态，从而暴露CTT结构域，稳定STING复合物的结构，但并不引起STING复合物构象变化。随后，Abe等[26]的研究证实，STING能够直接识别细胞质中的dsDNA，主要是STING中的第242～341位氨基酸结构域起作用，但是其对dsDNA的亲和力较低。另外，STING具有活化自噬通路以及STAT6转录因子的作用[17]。

cGAS-STING的免疫信号通路为：cGAS通过与dsDNA结合发生构象改变，cGAS活化从而促进ATP和GTP合成第二信使分子cGAMP，cGAMP与位于内质网上的STING蛋白二聚体结合，促使STING蛋白构象改变而激活，并与TRIM32和TRIM56合成泛素链来活化NEMO-IKKα/β进而招募活化TBK1/IKKε以及诱导IRF3/7和NF-κB的磷酸化，磷酸化的IRF3/7和NF-κB转移进细胞核中激活IFN基因的表达，并合成分泌IFN到细胞质中启动免疫应答。

3 cGAS-STING通路在抗病毒感染中的作用

病毒dsDNA能够诱导机体产生免疫反应，生成干扰素和其它炎症因子等。cGAS能识别病毒DNA的入侵，并通过STING-TBK1-IRF3信号通路启动针对大多数DNA病毒，如Ⅰ型单纯孢疹病毒(herpes simplex virus-1，HSV-1)、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、牛痘病毒(vaccinia virus，VACV)和杆状病毒等的免疫应答[8]。同时，研究证实人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、鼠白血病病毒和猿猴免疫缺损病毒等逆转录病毒在反转录酶作用下复制合成dsDNA激活cGAS-STING通路介导的干扰素通路[12]。Cavlar等发现STING缺失的细胞对细菌和病毒来源的DNA免疫反应所产生的IFN-β减少[27]；Anghelina等[28]发现在cGAS和STING缺失的老鼠中，TBK1、IRF3和STAT1的磷酸化水平降低，IFN-β分泌量降低，促炎症细胞因子减少，肝组织中抗病毒转录水平下降。从上述的研究可以看出，cGAS-STING通路在抗病毒反应中至关重要。

巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)感染细胞能引发细胞的多个抗病毒免疫通路，而细胞主要是通过诱导I型干扰素的产生来限制病毒的复制。体内感染CMV后，间质细胞中的cGAS-STING通路诱导产生I型干扰素，从而发挥抗病毒作用[9]。通过CRISPR-Cas9方法敲除STING发现，IRF3核转移能力和IFN-β基因表达受到抑制[9]。另外，在某些DNA病毒免疫中，cGAS-STING是细胞质中主要感受通路，如牛痘病毒(VACV)、I型单纯孢疹病毒(HSV-1)、腺病毒(adenovirus，Ad)等[9]。

卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)是DNA病毒的一种，与人类几种恶性肿瘤相关[29]。KSHV感染能够激活cGAS-STING通路，而cGAS和STING对KSHV从潜伏期复活的过程具有调控作用[29]。Ma等[29]敲除cGAS和STING后发现，缺失cGAS和STING后抑制了KSHV感染的内皮细胞中IFN-β的活化，IRF3和TBK1的磷酸化水平也降低，病毒从潜伏期复活的数量增多；其次，KSHV编码的多种蛋白(如病毒干扰素调节因子vIRF1)可以抑制cGAS-STING通路，并阻断IFN-β的活化。2013年，Li等[12]用cGAS双敲除的小鼠模型研究cGAS-STING通路抗病毒特性时发现，cGAS-/-小鼠的初级纤维母细胞和骨髓衍生的巨噬细胞不能正常对DNA病毒，如HSV-1和VACV进行应答，但可以对RNA病毒，如仙台病毒正常应答。这些研究表明，病毒感染后cGAS-STING通路作为主要的病毒DNA感受通路，诱导干扰素表达，引起细胞免疫应答，发挥抗病毒作用。

4 调控cGAS-STING通路的分子

cGAS-STING通路在病毒感染中诱导细胞产生固有免疫、发挥抗病毒作用，是主要的抗DNA病毒的胞质感受通路，但如果免疫系统被过度激发也会诱发自身免疫病。因此，宿主为了预防自身免疫病的出现，会采取负调控干扰素的策略。目前发现，参与STING介导的干扰素通路的负调控因子主要有自噬相关蛋白9 A(autophagy related 9 A，Atg9a)、3’修复外切核酸酶(Trex1)、E3泛素-蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase)RNF5、活性氧以及NS4B。此外，一些病毒编码的蛋白也能抑制cGAS-STING通路。Ma等[29]研究发现KSHV病毒vIRF1蛋白通过与STING结合，阻断STING与TBK1的相互作用，从而抑制STING的磷酸化和活化。Chen等[30]发现SARS冠状病毒木瓜样蛋白酶与STING-TRAF3-TBK1复合体相互作用，进而抑制IRF3的活化，负调控IFN-β信号通路。

目前已知的可激活cGAS-STING通路的分子比较少。Zhou等[3]用ZDHHC1双敲除的小鼠模型研究发现，内质网上的ZDHHC1蛋白对DNA病毒激发的依赖STING的免疫通路起正调控的作用。由于该通路在抗DNA病毒中发挥重要的作用，因此寻找调控cGAS-STING通路分子对抗病毒药物的研究意义重大。

5 cGAS-STING在病毒免疫逃逸中的作用

为了应对细胞的抗病毒机制，病毒也演变出各种靶向于DNA识别受体、接头蛋白、转录因子的逃逸策略。例如，Christensen等[31]研究孢疹病毒在STING通路中的逃脱机制时发现，PUL83蛋白通过抑制活化的IFI16的寡聚化反应，从而阻断IFI16将信号传递给STING，进而降低了IFN的表达。KSHV的ORF52位于核外周的细胞质中，该蛋白能够抑制cGAS的酶活性，也能够与DNA结合减少DNA的积累，但不能有效抑制IFN-I的表达，这是因为ORF52与DNA结合的亲和力远低于cGAS结合DNA的亲和力[32]。在HEK293T细胞中，KSHV的ORF45蛋白能与非磷酸化的IRF7相互作用，且与IRF7相比，ORF45是TBK1的优选底物，因此抑制IRF7活化，从而抑制IFN-I的表达水平[31]。另外，HSV-1中的ICP34.5蛋白和MHV88(murine hepatitis virus 88)中的ORF11蛋白能够与TBK1结合，降低IRF3的活性与IFN-I的表达水平[31]。Ma等[29]研究发现病毒vIRF1蛋白通过与STING结合，阻断STING与TBK1的相互作用，从而抑制STING的磷酸化和活化。

综上所述，病毒蛋白可以靶向cGAS-STING通路中的不同因子，从而阻断信号的传递以及干扰素的产生，最终逃脱宿主对其的免疫作用。

6 总结

宿主对病毒发挥的固有免疫已逐渐被重视，特别是免疫系统针对DNA病毒感染时的识别和信号传递的分子机制。cGAS-STING通路是至今发现的为数不多能够完整描绘诱导产生IFN-I过程的通路，是宿主固有免疫中抗病毒的重要途径之一。但通路中许多细节仍需深入研究，如激活通路的位点和机制、STING蛋白二聚化的机制、通路调节因子、病毒逃逸的机制等。立足于固有免疫系统探究cGAS-STING通路启动宿主或细胞抗病毒反应的作用，将为抗病毒药物的研发提供新的思路。

[1] Kato K, Ishii R, Goto E, et al. Structural and functional analyses of DNA-sensing and immune activation by human cGAS [J]. PLoS One, 2013, 8(10): e76983.

[2] Stein SC, Lam E, Falck-Pedersen E. Cell-specific regulation of nucleic acid sensor cascades: a controlling interest in the antiviral response [J]. J Virol, 2012, 86(24): 13303-13312.

[3] Zhou Q, Lin H, Wang S, et al. The ER-associated protein ZDHHC1 is a positive regulator of DNA virus-triggered, MITA/STING-dependent innate immune signaling [J]. Cell Host Microbe, 2014, 16(4): 450-461.

[4] Luo WW, Li S, Li C, et al. iRhom2 is essential for innate immunity to DNA viruses by mediating trafficking and stability of the adaptor STING [J]. Nat Immunol, 2016, 17(9): 1057-1066.

[5] Gao D, Wu J, Wu YT, et al. Cyclic GMP-AMP synthase is an innate immune sensor of HIV and other retroviruses [J]. Science, 2013, 341(6148): 903-906.

[6] Hu MM, Yang Q, Xie XQ, et al. Sumoylation promotes the stability of the DNA sensor cGAS and the adaptor STING to regulate the kinetics of response to DNA virus [J]. Immunity, 2016, 45(3): 555-569.

[7] Jin L, Hill KK, Filak H, et al. MPYS is required for IFN response factor 3 activation and type I IFN production in the response of cultured phagocytes to bacterial second messengers cyclic-di-AMP and cyclic-di-GMP [J]. J Immunol, 2011, 187(5): 2595-2601.

[8] 丁亮, 泥艳红, 胡勤刚, 等. 新型胞质DNA感受通路: cGAS-STING的研究进展 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2014, 41(9): 830-838.

[9] Lio CW, McDonald B, Takahashi M, et al. cGAS-STING signaling regulates initial innate control of cytomegalovirus infection [J]. J Virol, 2016, 90(17): 7789-7797.

[10] Li X, Shu C, Yi G, et al. Cyclic GMP-AMP synthase is activated by double-stranded DNA-induced oligomerization [J]. Immunity, 2013, 39(6): 1019-1031.

[11] 谢欣, 王孝伟, 刘俊义. 免疫途径抗HIV信号通路: cGAS-STING研究进展 [J]. 国际药学研究杂志, 2014, 41(5): 528-532.

[12] 原慧, 陶佳丽, 张亮, 等. cGAS——一种胞质DNA感应器的研究进展 [J]. 免疫学杂志, 2016, 32(11): 997-1000.

[13] Xiao TS, Fitzgerald KA. The cGAS-STING pathway for DNA sensing [J]. Mol Cell, 2013, 51(2): 135-139.

[14] Shu C, Li X, Li P. The mechanism of double-stranded DNA sensing through the cGAS-STING pathway [J]. Cytokine Growth Factor Rev, 2014, 25(6): 641-648.

[15] Chen Q, Sun L, Chen ZJ. Regulation and function of the cGAS-STING pathway of cytosolic DNA sensing [J]. Nat Immunol, 2016, 17(10): 1142-1149.

[16] 郑洋, 邢雅玲, 陈晓娟, 等. STING在宿主天然免疫信号通路中的调节作用 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2013, 10(1): 5-14.

[17] Burdette DL, Vance RE. STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol [J]. Nat Immunol, 2013, 14(1): 19-26.

[18] Konno H, Barber GN. The STING controlled cytosolic-DNA activated innate immune pathway and microbial disease [J]. Microbes Infect, 2014, 16(12): 998-1001.

[19] Zhong B, Yang Y, Li S, et al. The adaptor protein MITA links virus-sensing receptors to IRF3 transcription factor activation [J]. Immunity, 2008, 29(4): 538-550.

[20] Zhong B, Zhang L, Lei C, et al. The ubiquitin ligase RNF5 regulates antiviral responses by mediating degradation of the adaptor protein MITA [J]. Immunity, 2009, 30(3): 397-407.

[21] Jin L, Waterman PM, Jonscher KR, et al. MPYS, a novel membrane tetraspanner, is associated with major histocompatibility complex class II and mediates transduction of apoptotic signals [J]. Mol Cell Biol, 2008, 28(16): 5014-5026.

[22] Sun W, Li Y, Chen L, et al. ERIS, an endoplasmic reticulum IFN stimulator, activates innate immune signaling through dimerization [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(21): 8653-8658.

[23] Ishikawa H, Barber GN. STING is an endoplasmic reticulum adaptor that facilitates innate immune signalling [J]. Nature, 2008, 455(7213): 674-678.

[24] Barber GN. Cytoplasmic DNA innate immune pathways [J]. Immunol Rev, 2011, 243(1): 99-108.

[25] Paludan SR, Bowie AG. Immune sensing of DNA [J]. Immunity, 2013, 38(5): 870-880.

[26] Abe T, Harashima A, Xia T, et al. STING recognition of cytoplasmic DNA instigates cellular defense [J]. Mol Cell, 2013, 50(1): 5-15.

[27] Cavlar T, Ablasser A, Hornung V. Induction of type I IFNs by intracellular DNA-sensing pathways [J]. Immunol Cell Biol, 2012, 90(5): 474-482.

[28] Anghelina D, Lam E, Falck-Pedersen E. Diminished innate antiviral response to adenovirus vectors in cGAS/STING-deficient mice minimally impacts adaptive immunity [J]. J Virol, 2016, 90(13): 5915-5927.

[29] Ma Z, Jacobs SR, West JA, et al. Modulation of the cGAS-STING DNA sensing pathway by gammaherpesviruses [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(31): E4306-E4315.

[30] Chen X, Yang X, Zheng Y, et al. SARS coronavirus papain-like protease inhibits the type I interferon signaling pathway through interaction with the STING-TRAF3-TBK1 complex [J]. Protein Cell, 2014, 5(5): 369-381.

[31] Christensen MH, Paludan SR. Viral evasion of DNA-stimulated innate immune responses [J]. Cell Mol Immunol, 2017, 14(1): 4-13.

[32] Chan YK, Gack MU. Viral evasion of intracellular DNA and RNA sensing [J]. Nat Rev Microbiol, 2016, 14(6): 360-373.