口腔癌动物模型研究进展

续国强，卫佳宁，宋国华

(山西医科大学实验动物中心，实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原　030001)

口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤。有关研究报道，口腔癌中约有90%为鳞状细胞癌[1]。由于存在预后较差、易转移、复发率高[2]且口腔鳞状细胞癌(OSCC)发生、发展的具体病理机制尚未充分明确等问题，使得临床上OSCC的治疗效果仍未有明显改善。因此，建立一种较为完善的动物模型对人类口腔癌的预防、发生、转移及预后的研究十分重要。目前，许多学者建立了化学诱导、移植肿瘤及基因修饰等口腔癌动物模型，在抗肿瘤药物的药代动力学、实验性治疗方法的评价及部分原癌、抑癌基因的作用等方面进行了研究。本文就口腔癌动物模型研究进展进行综述。

1　自发性口腔癌动物模型

该模型中动物肿瘤的发生、发展过程与人类肿瘤的过程很相似，但由于自发性动物模型存在饲养量大、周期长、耗资大的缺点，目前还未有关自发性口腔癌动物模型的报道。因此，在实际操作过程中我们常用诱发动物模型来展开相应研究。

目前，我国对北极的研究相对滞后，更多还关注在自然科学方面，我国1999年才启动北极考察，比南极考察晚了整整14年，随着北极发生重大变化，中国对北极的研究短板凸显。

2　诱发性口腔癌动物模型

2.1　化学诱导口腔癌动物模型

2.1.1利用二甲基苯并蒽(9, 10-dimethyl-1, 2-benzanthracene，DMBA)诱导

二甲基苯并蒽为黄色粉末，是一种直接致癌剂，会使黏膜上皮细胞的遗传物质突变，黏膜细胞异常增生进而发生癌变。使用DMBA诱导建立口腔癌动物模型时，有涂抹法、直接注射法及DMBA局部植入三种方法。皇甫冰等[3]将0.5% DMBA丙酮溶液以每周3次的频率用小头棉签涂抹于中国地鼠双侧颊囊，第6周时发生非典型增生，第9周时有炎症反应并产生溃疡，第12周诱发原位癌，第15周便产生了鳞状细胞癌和浸润癌。Vijayalakshmi等[4]将0.5%的DMBA石蜡溶液涂抹于金黄色叙利亚地鼠颊囊，以每周三次的频率持续涂抹14周。与对照组相比，涂抹DMBA的地鼠全部成瘤且具有高肿瘤体积，肿瘤负荷以及突变型p53，PCNA和细胞周期蛋白D1的过度表达等特点。全知怎等[5]将DMBA溶液涂抹于地鼠颊黏膜，持续14周后诱癌组30只地鼠全部产生了鳞状细胞癌组织。李志革等[6]将DMBA丙酮溶液依次配置成0.1%～0.5% 5个浓度梯度后分别注射入五组金黄色地鼠的颊囊黏膜下，每周2次连续注射12周，最终0.3%组的诱瘤率最高。曹选平等[7]将DMBA含量为2%、体积为1 mm3的明胶海绵块植入SD大鼠的颌下腺进行口腔癌诱发实验，诱瘤率为42%。

利用DMBA诱导的动物模型肿瘤位置比较浅、重复性好、切取稳定且易于观察，与人类口腔肿瘤的生物学行为和生长特性很相似，也与人类口腔黏膜上皮癌变的病理变化过程很相似。正因如此，诸多学者认为DMBA诱导建立的口腔癌动物模型是目前较为理想的口腔癌实验动物模型之一。

2.1.2利用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide, 4NQO)诱导

与DMBA致癌模型相比，4NQO模型的诱癌过程避免了在用药初期引起的黏膜坏死和炎症，但局部涂抹4NQO溶液诱癌方式不自然，诱癌过程中会伴随有涂抹所产生的机械刺激且劳动强度相对较大。

2.2　移植性口腔癌动物模型

建立移植性口腔癌动物模型常用的实验动物有裸鼠以及新西兰大白兔等；常用的细胞株系有Tca8113人舌癌细胞系、CAL-27人舌鳞状癌细胞系、SCC9细胞系和VX2细胞系等。Zhao等[12]将100 μL培养基中的Tca8113细胞(2×106)以1560 r/min常温消化5 min，采用60只SPF级的BALB/cnu/nu雌性小鼠，皮下注射于小鼠足背，最终所有小鼠全部成瘤。Chen等[13]将200 μL生长培养基中的2×106个CAL-27细胞，皮下注射于6～8周龄时体重约20 g的雌性BALB/c-nude小鼠的背部皮肤中，结果显示，所有BALB/c-nude小鼠背部均成功诱瘤。Wu等[14]将荧光标记的SCC9细胞分为CD44+，CD44-和CD44±三组，并将它们分别注入随机分成三组的NOD/SCID小鼠舌侧缘；20 d后对所有小鼠进行分析并处死，接种CD44+细胞的小鼠在注射部位的成瘤率为100%，而在CD44-组中则为80%。此外，CD44+组中80%的小鼠发生颈部淋巴结转移，而CD44-组中只有30%的小鼠表现出颈部转移。李方龙等[15]利用中国海洋大学医药学院提供的VX2细胞系和低温冻存的VX2肿瘤组织块成功建立VX2荷瘤兔模型；并将该荷瘤兔的肿瘤用改良的穿刺植入法植入实验兔的舌体左侧建立兔VX2舌癌移植瘤模型。

与体型较小的啮齿类动物相比，用体型较大的新西兰大白兔建立口腔癌动物模型有明显优势，对于研究口腔癌的浸润及转移机制、影像学表现、发病机制、生物学特性以及评价实验性治疗方法的疗效等方面具有重要价值。与其它细胞株系相比，VX2肿瘤细胞株具有诱导所需时间短、种植成功率高、生物学性质稳定、转移与侵袭性强、在新西兰大白兔体内成瘤率高等优点。因此，目前有许多学者尝试采用这种细胞来研究口腔癌。

3　基因修饰动物模型

基因修饰动物模型是上世纪90年代新发展起来的将外源基因导入实验动物生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎后，在受体细胞染色体基因组中稳定地整合并表达和传递给后代的一类动物模型。转基因技术可通过在发育过程中精确激活、沉默等位基因，将基因表达控制在各个发育阶段。尽管长期以来大多数常见的肿瘤都出现了多种基因修饰动物模型，但发生于头颈部的肿瘤基因修饰动物模型却很罕见，而且是在最近才逐渐兴起[16]。全球第一例口腔癌的转基因实验动物模型—小鼠口腔—食管癌实验动物模型是由Oliver等[17]将启动子Epstein-Barr virus ED-L2与细胞周期素D1的cDNA 相结合并使用显微注射法将外源基因导入受精卵的雄原核，随后又利用回交纯化基因来建立的。在K14-CreERtam/LSL-K-rasG12D转基因鼠中将基因ras激活、基因p53失活后口腔黏膜上产生了不继续恶化癌变的乳头状瘤；但当该转基因鼠与基因p53表达缺陷的转基因鼠杂交后，产生的子代转基因鼠被化学药物他莫昔芬连续处理14 d后便会产生口腔癌[18]，从而成功建立他莫昔芬诱导的口腔癌变模型。Ocadiz-Delgado等[19]研究表明，牛角蛋白6介导形成的Tg转基因鼠在27周龄左右时位于其舌中部的上皮发生增生；并预测在此基础上辅以如化学致癌剂等其他外界致癌因素刺激会建立一种新型的口腔癌实验动物模型。近期，佘佐亚等[20]采用单独4NQO诱导和4NQO联合槟榔碱共同诱导的方式分别诱导Babl/c和C57BL/6绿色荧光蛋白转基因小鼠产生口腔癌，并比较这两品系小鼠对4NQO的敏感性以及它们在不同时间段时的各项病理变化；这种绿色荧光蛋白转基因小鼠口腔癌模型成为了活体荧光影像系统的一种重要的动物模型。

目前，新型的CRISPR/Cas9技术以一段RNA序列为导向来识别靶基因与传统的编辑技术相比，该系统定位更加准确、操作更加简洁、可控性更高，而且得到的突变可遗传给下一代。2017年Ping等[21]用张峰教授开发的在线工具(http://crispr.mit.edu/)选择合适的靶位点后，利用新型的CRISPR/Cas9技术在舌鳞状癌细胞系SCC-9中产生p75神经营养因子受体(p75NTR)基因组缺失的突变体，来研究p75NTR基因被敲除后对SCC-9细胞生物学功能的影响，从而为人类口腔癌在基因层面的治疗和防御提供了一个新的潜在靶标。Ping等虽然只是在细胞水平上利用CRISPR/Cas9 技术构建了口腔癌的细胞模型，但这也提示我们，可以将细胞水平的基因编辑模型和移植模型结合起来，通过CRISPR/Cas9 技术构建口腔癌细胞，利用手术将其移植到符合要求的实验动物体内，建立基因编辑的移植性口腔癌动物模型。还可将该技术应用于合适的实验动物受精卵中或直接在实验动物体内，利用该技术进行基因编辑以建立更符合需要的基因修饰口腔癌实验动物模型。

转基因口腔癌实验动物模型不但可以在整体组织器官水平上对动物进行研究，而且可以深入研究肿瘤在分子水平和细胞水平上的发生发展机制，为口腔癌临床治疗研究、治疗药物筛选以及口腔癌发病机制研究提供了一个理想的实验体系。利用转基因法建立的口腔癌动物模型，可以准确地增强或失活某些基因的表达，可在分子水平上研究口腔癌形成过程中的各种病变。但利用转基因法建立实验动物模型时，被导入的外源基因在宿主基因组中的行为难控制、表达混乱，甚至不表达、转录效率低、无法遗传给后代、转基因鼠不能形成多个突变以及成活率不高等缺点。新一代的 CRISPR/Cas9基因编辑技术虽然操作性更强、可控性更高，但在实际应用的过程中也具有“脱靶”等问题亟待我们解决。

4　几种模型的比较

口腔癌动物模型主要有自发性口腔癌动物模型、诱发性口腔癌动物模型、基因修饰口腔癌动物模型。其中自发性口腔癌动物模型由于其耗资巨大、费时且过程繁琐，故而现今还未有该模型的相关报道。

目前，较为成熟且使用较多的是诱发性口腔癌动物模型。化学诱导口腔癌动物模型具有可严格控制各种条件，在较短的时间能复制出大量的口腔癌动物模型，能够较好地模拟人类口腔癌的发生过程等优点。但同时也具有动物意外死亡率较高，进行局部治疗性实验比较困难，与人类口腔癌的某些特征有较大差异，不适合在进展研究及肿瘤治疗等领域应用的缺点。其中DMBA涂抹法诱瘤率接近100%，DMBA直接注射法由于注射浓度的不同其诱瘤结果也不同，最高为87%，最低为25%。移植性口腔癌动物模型适用于短时间内需要得到大量相同肿瘤模型的实验，这种模型所产生的肿瘤具有个体差异较小、移植部位选择灵活、生长速率较一致、可观察到肿瘤浸润和转移过程、保留人类口腔癌部分病理学、生物学特性以及高接种成活率等优点。但该方法也存在每次接种耗时较长、需无菌条件、对实验动物创伤较大、术后感染率较高以及无法研究组织由正常状态逐渐发展为癌症的完整过程等不足。该法的诱瘤率也接近于100%，其中VX2肿瘤细胞株与其它口腔癌细胞株系相比在诱导时间，成功率，稳定性等方面有着独到优势。

基因修饰口腔癌动物模型既可在整体组织器官水平对动物进行研究，又可在分子和细胞水平深入研究肿瘤的发生发展机制；可较为完整的观测肿瘤的浸润、侵袭、转移等过程，是目前构建口腔癌动物模型的发展趋势。但在基因敲除的所有细胞中以及在转基因的许多细胞中都存在突变，而在人肿瘤发展期间，突变仅在由正常细胞包围的少数肿瘤细胞中出现，并且早期遗传改变可能影响胚胎发育，从而混淆肿瘤的发生。转基因小鼠和敲除小鼠通常不具有多重突变，也不发展转移，而这正是人类肿瘤发生的标志。此外，该模型也存在转录效率低或外源基因表达效率低、基因导入位置不稳定、脱靶问题较为严重等问题。

5　展望

动物模型不仅是研究疾病的发生发展、预防以及治疗的重要材料，而且是测试临床新技术的重要平台。目前，化学诱导口腔癌动物模型的研究已步入相对成熟的阶段，特别是4NQO模型和DMBA模型已经被广泛应用于癌变以及癌前病变等研究中。近年来因CRISPR/Cas9基因编辑技术设计简洁高效、使用方便快捷以及适用范围广等优势被快速地应用于各种基因修饰动物模型的建立中[22]。在未来的研究中，将高通量测序技术与新型的CRISPR基因编辑技术相结合，可以更加高效的利用所构建的动物模型来深入研究口腔癌的发病机制、探索新的治疗方案，有利于将实验研究结果快速转化到临床应用中，具有广阔的发展前景。

参考文献：