慢病毒介导shRNA抑制β-连环蛋白对儿童髓母细胞瘤细胞株生物学行为的影响

万 江 张海燕 刘义红 李新涛 涂胜英 吴丽敏

髓母细胞瘤(MB)是一种好发于儿童的颅内恶性肿瘤，占儿童中枢神经系统肿瘤的 10%～20%，发病高峰在7岁左右，病情进展迅速，治疗棘手[1,2]。常采用外科手术切除后辅助放化疗，疗效不理想[3,4]。MB的病因及发病机制迄今尚不明了，可能与多条细胞信号转导通路的异常有关，其中Wnt信号转导通路是调控细胞增殖和分化的重要途径，肿瘤中普遍存在Wnt信号转导通路中关键效应物β-连环蛋白(β-catenin)的异常激活[5,6]。本研究通过构建靶向干扰β-catenin基因的shRNA的慢病毒载体，感染儿童MB细胞株DOAY，建立稳定抑制β-catenin基因表达的细胞株，观察β-catenin对其增殖、凋亡、侵袭和迁移等的影响。

1 方法

1.1 实验材料 慢病毒载体包装系统购自美国System Biosciences公司，其中pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒包含绿色荧光蛋白(GFP)基因，pRsv-REV、pMDlg-pRRE和pMD2G质粒包含病毒包装所需元件；DAOY购自中国科学院上海细胞库；DNA凝胶回收试剂盒、BamH I和EcoR I内切酶、DNA连接试剂盒购自日本TaKaRa公司；Opti-DMEM培养基、Lipofectamine 2000脂质体和TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国ABI公司；兔抗人β-catenin一抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗和ECL显色试剂盒购自美国Santa Cruz公司；Annexin V/PI双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自德国Bender公司。

1.2 靶向β-catenin的shRNA慢病毒载体的构建与包装

1.2.1 shRNA寡核苷酸链的设计合成 参照文献[7]、根据β-catenin miRNA序列(NM-BC053065.1)设计shRNA 1、2、3和阴性对照(NC)，每条核苷酸链的中间添加茎环结构TTCAAGAGA，正、反义链的5'端分别引入GATCC和AATTC，分别与BamH I和EcoR I酶切后的粘性末端互补，序列见表1，经Blast比对与人类其他基因编码序列无同源性，委托上海吉玛制药技术有限公司合成。

表1 靶向β-catenin的shRNA寡核苷酸链序列

1.2.2 pCDH-shRNA慢病毒质粒构建 用BamH I和EcoR I对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒质粒进行双酶切， 将shRNA寡核苷酸链退火形成双链DNA并与双酶切后的质粒连接，连接产物转化感受态DH5α大肠杆菌，在氨苄青霉素琼脂培养基平板上培养，筛选阳性克隆后委托上海吉玛制药技术有限公司测序验证。

1.2.3 Lentivirus-shRNA慢病毒包装和滴度测定 293T细胞用RM1640 [含10﹪胎牛血清(FBS)、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素]培养，接种于6孔板。通过Lipofectamine 2000介导慢病毒载体包装系统的质粒共转染293T细胞。转染后收集含有慢病毒颗粒的细胞上清液，经0.45 μm的过滤器过滤后获得慢病毒纯化液，通过实时荧光定量PCR测定病毒滴度。

1.3 靶向β-catenin的shRNA慢病毒的筛选 ①DOAY细胞株用RM1640(含10﹪FBS、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素)于37 ℃、5% CO2条件培养，隔天更换培养液，细胞生长至85%融合时用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期细胞接种于6孔板。②共分为5组(每组6孔)，Lentivirus(LV)-shRNA 1、2、3和NC组分别用包装好的Lentivirus-shRNA 1、2、3和NC感染细胞，每孔加入100 μL病毒液，同时设置未用病毒感染的空白对照组(Blank)。6 h后更换正常培养液继续培养。③感染72 h后，在荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况，首先在白光视野下计数细胞的总数目，再在荧光视野下计数表达荧光的细胞数目，转染效率=(荧光表达细胞数目/白光视野细胞总数)×100%，取10个视野，计算其平均值。④感染后培养96 h，收集各组细胞。 ⑤RT-PCR检测细胞中β-catenin mRNA表达：细胞总RNA的提取和逆转录按照试剂盒的说明书进行操作，A260/A280比值1.8～2.0提示样品RNA满足实验要求。以cDNA作为模板进行PCR扩增，引物系由上海吉玛制药技术有限公司设计和合成。β-catenin引物F：5’-GTGCTGAAGGTG-CTATCTGTCTGC-3’，

R：5’-TGAACAAGACGTTGACTTGGATCTG-3’；GAPDH引物F：5’-CATGAGAAGTAT-GACAACAGCCT-3’，R：5’-AGTCCTTCC-ACGATACCAAAGT-3’。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad分析系统扫描分析，目的基因相对表达量=目的基因光密度值/GAPDH光密度值。⑥Western Blot检测细胞中β-catenin蛋白表达：提取细胞总蛋白并用BCA法测定浓度，以80 μg总蛋白上样，采用10%的SDS-PAGE胶、PVDF膜，β-catenin兔抗人一抗工作液(1∶100)4 ℃孵育过夜，HRP标记的羊抗兔二抗工作液(1∶100)37 ℃孵育1 h，ECL显色，用Bio-Rad分析系统扫描分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白光密度值/GAPDH光密度值。

1.4 稳定细胞株的筛选 ①取对数生长期DOAY细胞接种于6孔板，加入不同浓度(1、2、3、4和5 μg·mL-1)的嘌呤霉素，选择在10～14 d内让全部细胞死亡的最低浓度为最佳筛选浓度。②用1.3筛选实验中对β-catenin抑制效果最佳的LV-shRNA感染DOAY细胞，之后将细胞接种于6孔板，孵育24 h后加入嘌呤霉素，使之达到①中最佳筛选浓度。每隔2 d更换新的含嘌呤霉素(最佳筛选浓度)的培养液，连续培养10 d。收集抗性细胞，获得稳定抑制β-catenin表达的DOAY细胞株。以相同方法用嘌呤霉素筛选稳定感染LV-NC的DOAY细胞株。

1.5 干扰β-catenin对细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响 分3组，LV-shRNA 组：1.4中筛选得到的稳定抑制β-catenin表达的DOAY细胞株；LV-NC组：1.4中筛选得到的稳定感染Lentivirus-NC的DOAY细胞株；Blank组：未感染病毒的DOAY细胞株。

1.5.1 MTT检测细胞增殖能力 将细胞接种于96孔板，于接种后24、48、72、96、120 h每孔加20 μL 的MTT溶液(5 mg·μL-1)。继续孵育4 h后，去掉原培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，室温振摇15 min，酶标仪测定各组OD(570)值并绘制曲线。

1.5.2 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞接种于6孔板，孵育48 h后收集，按Annexin V/PI双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。

1.5.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力 使用无血清的RM1640培养液将细胞接种于自带基质胶的Transwell小室上室，下室加入RM1640+10%FBS。孵育48 h后，擦去靠近基底膜内室的细胞，另一面细胞经10%甲醇固定，PBS洗涤，结晶紫染色，PBS洗涤，显微镜下观察细胞并记数。

1.5.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 细胞接种于6孔板，生长至90%融合时，于6孔板底部沿直线划痕，并更换为无血清的RM1640培养液。孵育48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，Gimesa染色，观察细胞迁移情况。细胞相对迁移能力=0 h划痕距离-48 h划痕距离。

2 结果

2.1 慢病毒感染和稳定细胞株筛选 图1显示，感染72 h后，Blank组细胞未见GFP表达，LV-shRNA 1、 2、3和NC 组细胞感染效率分别为(91.2±3.1)%、(93.2±2.9)%、(90.6±3.2)%和(89.9±2.1)%，经方差分析各组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图2A中RT-PCR检测显示，各LV-shRNA组β-catenin mRNA表达均低于LV-NC组(0.95±0.21)和Blank组(0.89±0.23)，LV-shRNA 1组(0.24±0.09)低于LV-shRNA 2组(0.47±0.15)和LV-shRNA 3 组(0.53±0.13)，差异均有统计学意义(P<0.05)；图2B Western Blot显示，各LV-shRNA组β-catenin蛋白表达均低于LV-NC组(0.89±0.19)和Blank组(0.81±0.20)，LV-shRNA 1组(0.15±0.07)低于LV-shRNA 2组(0.38±0.14)和LV-shRNA 3组(0.41±0.14)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 荧光显微镜观察各组DOAY细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况

图2各组DOAY细胞中β-catenin的mRNA(A)和蛋白(B)表达情况，LV-shRNA1对DOAY细胞增殖的影响(C)

注 M：Marker，1、2、3、NC和B分别为LV-shRNA 1、2、3、NC组和Blank组

综合病毒感染效率和LV-shRNA干扰效率，LV-shRNA 1对β-catenin抑制效果最好，以4 μg·mL-1嘌呤霉素筛选稳定表达LV-shRNA 1的DOAY细胞株。

2.2 LV-shRNA 1对DOAY细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响 ①增殖：MTT细胞生长曲线(图2C)显示，LV-shRNA 1组第12、24、36、48、72 h时OD(570)值低于LV-NC组和Blank组(P<0.05)。②凋亡：双变量流式细胞仪散点图(图3)显示，LV-shRNA 1组细胞总凋亡率[(31.3±4.2)%]高于LV-NC组[(13.3±3.3)%]和Blank组[(17.4±3.1)%]，P<0.05。③侵袭：Transwell实验(图4)显示，LV-shRNA 1组穿膜细胞数目(23.4±8.3)少于LV-NC组(69.8±14.7)和Blank组(74.2±16.7)，P<0.05。④迁移：细胞划痕实验(图5)显示，LV-shRNA 1组细胞迁移距离[(314.6±47.1)μm]小于LV-NC组 [(689.4±73.6)μm]和Blank组[(701.5±79.0)μm]，P<0.05。

图3AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测DOAY细胞凋亡情况

注 Q1：中晚期凋亡细胞；Q2：坏死细胞；Q3：存活细胞；Q4：早期凋亡细胞

图4 Transwell实验检测DOAY细胞的侵袭能力(×100)

图5细胞划痕实验检测DOAY细胞的迁移能力

3 讨论

研究显示，Wnt信号转导通路在调控细胞增殖和分化等过程中发挥重要作用，且与多种肿瘤的发生和发展密切相关[8]。此外，还参与神经细胞的发育、分化和成熟，对原始神经干细胞的分化和成熟以及中枢神经系统的发育至关重要[9]。β-catenin是Wnt信号转导通路中的关键效应因子，β-catenin的异常激活可使神经干细胞向肿瘤干细胞分化，从而参与MB的发生和发展[10]。当Wnt信号转导通路失活时，胞浆中的β-catenin主要与细胞膜上的E-钙黏蛋白结合，部分与胞浆中的 APC蛋白、Axin蛋白、糖原合成酶激酶-3 (GSK-3β)和酪蛋白激酶-1(CK-1)相互作用，形成β-catenin降解复合体。磷酸化的β-catenin降解复合体泛素化，经泛素-蛋白酶体系统(UPS)降解，从而使细胞内β-catenin含量维持在正常水平[11，12]。当Wnt信号转导通路激活时，

β-catenin降解复合体解散，磷酸化与泛素化过程受阻，胞质内β-catenin不断蓄积，并通过核孔转运进细胞核，作为转录启动子与T细胞因子/淋巴增强子(TCF/LEFs) 等转录因子家族结合，从而激活细胞周期蛋白-1(Cyclin D-1)和C-myc等癌基因的转录和表达，导致肿瘤的发生和发展[11,12]。马俊艳等[13]证实，β-catenin在人脑干神经胶质瘤中的表达随肿瘤分级的增加而增加，推测其可能与脑干神经胶质瘤的恶性程度有关。另有研究[14]发现， β-catenin 在MB组织中的阳性表达率高于正常组织(66.7%vs10.0%，P<0.05)，推测其可能参与MB的发生和发展。因而，深入探索β-catenin与MB的关系，从分子生物学水平寻求特异性治疗靶点，将为MB的防治提供新的思路。

RNA干扰技术(RNAi)是近年来广泛用于调控生物基因表达与功能的技术，通过体外转录或体内表达的小干扰RNA(siRNA)诱导序列特异的目的基因沉默，该技术目前已成为研究基因功能和实现基因治疗的热点。如何将siRNA完整地送入靶细胞是目前制约RNAi技术广泛应用的关键。目前常用的载体主要有质粒和病毒，不同的表达载体在合成过程、转染效率和转染效果方面各有优缺点。质粒载体的制备较简单，但是导入效率低，且无法长期稳定表达。病毒载体主要有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等，其中慢病毒载体既能转染分裂期细胞又能转染非分裂期细胞，能够将siRNA整合至靶细胞中实现长期稳定的表达，而且转导效率高、免疫反应小[15]。在本次实验中我们构建了小发卡RNA(shRNA)，以克服siRNA半衰期短和无法持久表达等缺点，进一步加工成shRNA的慢病毒载体，从而将shRNA高效导入细胞并稳定表达。在shRNA慢病毒载体加工的过程中，对于靶基因位点的选择十分关键，因此对shRNA编码序列的选择尤为重要。应尽量避免5'和3'非编码区和起始密码子区等调节蛋白结合位点区域，在本研究中我们选择了编码区起始密码子下游433、769、1 181和2 348共4个位点作为干扰靶点，有效避免了某一位点不能干扰β-catenin表达的情况，同时还设置了阴性对照序列，从而排除了转染序列本身对β-catenin表达的影响。

本研究结果发现， LV-shRNA 1对β-catenin抑制效果最好，通过嘌呤霉素筛选，获得了稳定抑制β-catenin表达的DOAY细胞株。细胞接触生长抑制性丧失是恶性肿瘤的重要特点，本研究观察了抑制β-catenin表达对细胞增殖和凋亡的影响，结果发现，LV-shRNA 1组第12、24、36、48、72 h时的OD值减小，细胞总凋亡率升高，说明抑制β-catenin表达能够显著抑制DOAY细胞增殖并促进其凋亡。MB肿瘤细胞有沿脑脊液产生播散性种植的倾向，本研究进一步观察了抑制β-catenin表达对DOAY细胞侵袭和迁移能力的影响，结果发现，LV-shRNA 1组穿膜细胞数目减少，细胞迁移距离缩短，说明抑制β-catenin表达减弱了肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。其原因可能为：抑制β-catenin表达，一方面阻碍Wnt信号转导通路下游Cyclin D1和C-myc等癌基因的表达；另一方面增加了肿瘤细胞间的黏附作用，使癌细胞浸润性和分散性生长受阻。

综上所述，稳定抑制β-catenin表达可抑制DOAY细胞的增殖，降低其侵袭和迁移能力，促进其凋亡，β-catenin有潜力成为治疗MB的新靶点。

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