响应面法优化超声波提取南瓜皮叶黄素的工艺研究

2018-01-22 17:10,,,3,*,,3
食品工业科技 2018年1期
关键词:异构体叶黄素液固比

,,,3,*,,3

(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014;3.国家蔬菜加工技术研发分中心,江苏南京 210014)

南瓜(CucurbitamoschataDuch)是双子叶植物门葫芦科南瓜属植物,在世界各地都有广泛种植[1]。南瓜加工副产物-南瓜皮和南瓜籽约占整个南瓜的10%~40%,通常被作为废弃物处理,但南瓜皮中含有丰富的叶黄素(0~17 mg/100 g FW)[2],其主要以叶黄素酯的形式存在,不易被人体吸收,需要经过提取、皂化处理才能获得人体所能吸收的游离态叶黄素。

图1 反式叶黄素及叶黄素顺式异构体 Fig.1 All trans utein and its cis isomers

医学研究表明,叶黄素具有比β-胡萝卜素更优良的抗氧化性能,能抵御自由基在人体内造成的细胞与器官损伤,还能减少某些慢性疾病如癌症、心脏病、II型糖尿病等的发病[3-4]。然而,由于叶黄素分子中含多个共轭碳碳双键,使其具有多种异构体(图1)。研究发现,在生物体内反式叶黄素的生物活性较其顺式异构体高很多[5]。因此,优化南瓜皮提取过程,提高制品中反式叶黄素的含量、减少顺式异构体的形成,是研究需要解决的问题。

近年来,超声波提取作为一种颇具优势的提取方法,逐渐应用于天然植物活性成分的提取中[6-9],其主要利用超声波在液体中的空化作用加速植物有效成份的浸出[10]。尽管超声波提取具有提取温度低、提取效率高、提取时间短的独特优势,但不当的超声条件也可能导致叶黄素的降解和异构化[11-12]。因此,本研究以南瓜皮为原料,利用超声波提取其中的叶黄素,通过考察各因素对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响,采用响应面法优化南瓜皮中叶黄素的提取工艺条件,以期获得适宜的提取方法,为叶黄素的高效提取及南瓜皮的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

“蜜本”南瓜(CucurbitamoschataDuch. cv.Miben) 江苏省南京市孝陵卫农贸市场,取南瓜皮,经冷冻干燥、粉碎过40目筛后,制成南瓜皮粉(水分含量为3.56%±0.08%,w/w),冷藏备用;反式叶黄素标准品 纯度97%,CAS#:X6250 美国Sigma公司;甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)、甲醇(均为色谱纯) 美国天地公司;纯净水 杭州娃哈哈集团有限公司;氮气(纯度99.99%) 南京文达特种气体有限公司;其他试剂均为分析纯。

1200高效液相色谱仪(配二极管阵列检测器) 美国安捷伦科技有限公司;6530精确质量数四级杆-飞行时间质谱仪(6530 Q-TOF) 美国安捷伦科技有限公司;KQ-300GVDV台式三频恒温数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;FD-1A-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;BS224S电子分析天平 北京赛多利斯科学仪器公司;TG16-WS台式高速离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;MD 200氮气吹扫仪 杭州奥盛仪器有限公司;FW100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 超声提取 参考付莉等[2]的方法并稍作修改,准确称取0.50 g南瓜皮粉置于50 mL具塞三角瓶中,按适量液固比加入一定体积比的提取试剂,在超声频率为45 kHz,在一定的超声功率下提取一段时间,采用冷却水循环控制水浴温度为室温。待提取结束后,将提取液抽滤,于4000 r/min下离心10 min,收集上清液。

参考胡建中等[13]的方法并稍作修改,向15 mL上清液中加入2 mL 40% KOH-甲醇溶液,摇匀后置于暗处25 ℃皂化12 h,转移至分液漏斗,加入30 mL正己烷,振荡1 min,再加入38 mL 10%硫酸钠溶液,收集上层溶液,45 ℃旋转蒸发,氮气吹干,获得南瓜皮叶黄素提取物。所有操作均在避光环境下完成。

1.2.2 反式叶黄素及其顺式异构体分析 用5 mL甲醇复溶南瓜皮叶黄素提取物,并进行高效液相色谱-二极管阵列检测-大气压化学电离质谱分析[11,14]。

1.2.2.1 C30-HPLC-DAD-MS分析条件 HPLC分析条件:YMC-C30色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:A为水-MTBE-甲醇(5∶25∶75,V/V/V),B为水-MTBE-甲醇(5∶85∶10,V/V/V);洗脱梯度设置:0~4.5 min,95%→80% A;4.5~12.5 min,80%→50% A;12.5~18 min,50%→25% A;18~24 min,25%→5%A;24~30 min,5%→95% A;二极管阵列检测器,检测波长:450 nm;流速:0.6 mL/min;进样量:20 μL;柱温:25 ℃。

MS条件:色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10 μL/min;离子源:APCI+;扫描范围:m/z 80~1000;毛细管电压:2500 V;干燥气体:5 L;雾化气体:20 psi;气化温度:350 ℃;蒸汽温度:400 ℃;电晕电流:4 μA。

1.2.2.2 反式叶黄素标准曲线绘制 精确称取1.0 mg反式叶黄素标准品,用甲醇溶解并定溶于25 mL棕色容量瓶,混匀,制成质量浓度为40 μg/mL的标准液。分别取一定量标准液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容并混匀,制成浓度2、4、6、8、10、20 μg/mL的系列标准溶液,按照1.2.2.1 HPLC分析条件,每个系列浓度进样3次,以反式叶黄素系列标准液质量浓度为横坐标、相应吸收峰面积为纵坐标,绘制反式叶黄素标准曲线,得到回归方程Y=28.14X+104.14,R2=0.9991。

1.2.2.3 南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体定性定量分析方法 对于南瓜皮中的反式叶黄素,可对照反式叶黄素标准品的色谱图,根据其保留时间的一致性定性鉴定,再根据峰面积大小,由所绘制的反式叶黄素标准曲线,计算其含量;由于叶黄素顺式异构体没有相应的标准品,因此利用其特征吸收波长、紫外-可见光谱特性、顺式吸收强度(Q值,顺式吸收峰“高度值”与最大吸收波长“高度值”之比)以及质谱离子碎片特性[15-16]进行定性分析,再通过替换计算法[15]对叶黄素顺式异构体进行定量测定。叶黄素提取量计算公式如下:

式中:C-叶黄素提取量,μg/g dw;Y-吸收峰面积;l-复溶溶剂体积,mL;m-样品质量,g。

1.2.3 南瓜皮叶黄素提取溶剂的选择 在查阅国内外大量参考文献[17-21]的基础上,选取5种文献报道中的叶黄素提取最佳溶剂,分别为正己烷-乙醇-丙酮-甲苯(10∶6∶7∶7,V/V/V/V:)、丙酮-石油醚(2∶1,V/V)、无水乙醇、氯仿-乙醇(3∶2,V/V)及乙醇-石油醚(2∶1,V/V),按照1.2.1所述工艺,固定参数:超声功率210 W,液固比30∶1 mL/g,提取时间30 min,提取南瓜皮中叶黄素,比较不同试剂对提取物中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响,获得南瓜皮叶黄素的最佳提取溶剂。

1.2.4 单因素实验设计

1.2.4.1 溶剂比例对南瓜皮中叶黄素提取量的影响 按照1.2.1项下方法,参考文献[2]中的方法,设置乙醇/石油醚体积比分别为2∶1、2∶2、2∶3、2∶4、2∶5,于超声功率210 W,提取时间30 min,液固比30∶1 mL/g条件下进行实验,考察乙醇/石油醚体积比对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响。

1.2.4.2 超声功率对南瓜皮中叶黄素提取量的影响 按照1.2.1项下方法,参考文献[2]中的方法,设置超声功率分别为150、180、210、240、270 W,于乙醇/石油醚体积比2∶1,提取时间30 min,液固比30∶1 mL/g条件下进行实验,考察超声功率对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响。

1.2.4.3 液固比对南瓜皮中叶黄素提取量的影响 按照1.2.1项下方法,参考文献[2]中的方法,设置液固比分别为20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g,于乙醇/石油醚体积比2∶1,超声功率180 W,提取时间30 min条件下进行实验,考察液固比对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响。

1.2.4.4 提取时间对南瓜皮中叶黄素提取量的影响 按照1.2.1项下方法,参考文献[2]中的方法,设置提取时间分别为20、30、40、50、60 min,于乙醇/石油醚体积比2∶1,超声功率180 W,液固比35∶1 mL/g条件下进行实验,考察提取时间对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响。

1.2.5 响应面法实验设计 在单因素实验的基础上,运用 Design Expert 8.0.6软件,选取三个主要因子:超声功率(x1)、提取时间(x2)、液固比(x3),采用中心组合实验设计(Face-centred Central Composite design,FCCD),以反式叶黄素提取量(Y1)、叶黄素顺式异构体提取量(Y2)为响应值进行三因素三水平的中心组合实验并对结果进行分析,实验设计编码值如表1所示。

表1 中心组合实验因素水平表Table 1 Levels and factors of central composite experiments

1.3数据处理

2 结果与分析

2.1南瓜皮中的叶黄素鉴定

采用C30-HPLC-DAD-MS方法测定了南瓜皮叶黄素提取物中的主要成分,结果如图2所示。通过与标准品比对,结合光谱图(图3)、质谱图(图4)与相关文献[21-22]共鉴定出1种反式叶黄素及4种叶黄素顺式异构体(9-顺式叶黄素,9′-顺式叶黄素,13/13′-顺式叶黄素,15-顺式-叶黄素)。由于13-顺式叶黄素与13′-顺式叶黄素相似的光谱性质,本研究未能分离鉴定。

基于此,本研究进一步考察超声提取过程中各因素对南瓜皮中叶黄素及其顺式异构体的影响。

图2 南瓜皮中叶黄素提取物的HPLC色谱图Fig.2 HPLC Chromatograms of lutein and its cis isomers in extract of pumpkin peels注:峰1为15-顺式叶黄素,峰2为13/13′-顺式叶黄素,峰3为反式叶黄素,峰4为9-顺式叶黄素,峰5为9′-顺式叶黄素,图3同。

图3 反式叶黄素及其顺式异构体的光谱图Fig.3 Spectrum overlays of trans lutein and its cis isomers

图4 反式叶黄素及其顺式异构体的质谱图Fig.4 Positive ion APCI mass spectra of trans lutein and its cis isomers

2.2南瓜皮叶黄素最佳提取溶剂的确定

研究比较了正己烷-乙醇-丙酮-甲苯、丙酮-石油醚、无水乙醇、氯仿-乙醇及乙醇-石油醚5种提取溶剂对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响,结果见表2,从表中可以看出不同溶剂之间反式叶黄素提取量存在显著差异(p<0.05),其中乙醇-石油醚(2∶1,V/V)提取反式叶黄素的提取量最高,达到(116.5±0.9)μg/g dw,而无水乙醇提取效率最差,可能是因为乙醇是强极性溶剂,石油醚是弱极性溶剂,二者的介电常数相差较大,混合后溶剂极性改变范围也较大,更容易与叶黄素的极性接近,提高了萃取叶黄素的能力[17];而对于叶黄素顺式异构体而言,乙醇-石油醚(2∶1,V/V)的提取量与正己烷-乙醇-丙酮-甲苯(10∶6∶7∶7,V/V/V/V)和丙酮-石油醚(2∶1,V/V)的提取量之间均无显著差异。此外,乙醇和石油醚价格便宜均较易获得,且乙醇和石油醚沸点较低,后续的分离提纯工序中容易除去。因此,综合考虑反式叶黄素提取效率及溶剂的安全性,本实验选取乙醇-石油醚混合溶剂作为南瓜皮中叶黄素的提取溶剂。

表2 不同提取溶剂对南瓜皮叶黄素提取量的影响Table 2 Effects of different solvents on extraction efficiency of lutein from pumpkin peel

注:不同小写字母表示不同溶剂提取叶黄素之间存在显著性差异(p<0.05)。

2.3单因素实验结果分析

2.3.1 溶剂比例的影响 由图5a可知,当乙醇与石油醚体积比分别为2∶1和2∶2时,南瓜皮中反式叶黄素提取量没有显著性差异(p>0.05)。随着石油醚比例的进一步增加,反式叶黄素提取量逐渐减少,原因可能是由于增加石油醚比例,混合溶剂的极性下降,脂溶性杂质溶出增多,与反式叶黄素竞争溶剂,导致反式叶黄素溶出率降低[23]。另一方面,由于石油醚挥发度较高,具有较高的溶剂蒸汽压,当溶剂蒸汽进入空化泡后为空化泡的破裂提供缓冲作用,减少了冲击力和剪切力[24],使反式叶黄素降解速率减小,顺式异构体一直呈下降趋势,综合考虑反式叶黄素提取效率及溶剂安全性,溶剂比例选择乙醇-石油醚为2∶1较为合适。

2.3.2 超声功率的影响 由图5b可以看出,超声功率150~270 W范围内,南瓜皮中反式叶黄素提取量随超声功率的增大先增加后减小。说明低功率超声波对叶黄素的辅助浸出作用有限,李刚刚等[25]的研究中也发现功率过低不能充分提取叶黄素,而在高功率超声波作用下,其空化效应和机械作用增强[16],叶黄素溶出速率增加,但超声功率过大,导致反式叶黄素异构化[26],因此叶黄素顺式异构体提取量逐渐增大。故选择超声功率150、180、210 W作为响应面实验三水平。

图5 不同因素对南瓜皮中反式叶黄素及其顺式异构体提取量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on the trans lutein and its cis isomers extraction from pumpkin peel注:叶黄素顺式异构体提取量为9-顺式-叶黄素、9′-顺式-叶黄素、13/13′-顺式-叶黄素及15-顺式-叶黄素提取量之总和。

2.3.3 液固比的影响 如图5c,当液固比在20∶1~40∶1 (mL/g)范围内,液固比对南瓜皮中反式叶黄素及叶黄素顺式异构体提取量的影响一致,均呈先增加后减少的趋势,当液固比为35∶1 mL/g时,反式叶黄素和叶黄素顺式异构体分别达到最大值(194.3±14.9) μg/g dw和(13.8±1.6) μg/g dw。说明随着溶剂用量的增大,物料与溶剂的接触面浓度差增加、渗透压增大,叶黄素更容易浸出[27]。当溶剂比例超过35∶1 mL/g,反式叶黄素及其顺式异构体提取量逐渐下降,可能由于固液比增大,杂质提取量大。故选取液固比30∶1、35∶1、40∶1 mL/g作为响应面实验三水平。

2.3.4 超声时间的影响 由图5d可见,随着超声时间的延长,南瓜皮反式中叶黄素提取量先增加后减少。说明在提取初期,叶黄素没有充分溶出,随着时间的延长,超声波中的空化泡爆破时产生大的涡漩及在提取物表面产生的微射流都加速了叶黄素的扩散速率[28-29],在40 min达到最大值后,继续延长超声时间,反式叶黄素提取量开始下降,而叶黄素顺式异构体提取量一直呈线性增加,这可能与长时间超声产生热量积聚导致反式叶黄素发生氧化降解有关[30],因此,选择提取时间30、40、50 min作为响应面实验三水平。

2.4响应面优化实验

2.4.1 模型的建立及显著性检验 FCCD实验设计与结果见表3,通过Design Expert 8.0.6软件对表3中的数据进行二次多元回归拟合,得到回归方程如下:

Y1=168.54+48.09x1-6.38x2+17.36x3+0.89x1x2-1.58x1x3-0.8x2x3+1.98x12-0.31x22+0.25x32Y2=9.63+3.51x1+1.60x2+0.11x3+0.53x1x2-0.73x1x3-0.83x2x3-0.59x12-0.26x22-1.24x32

对回归模型进行方差分析(表4)可知,反式叶黄素提取量的回归模型(p<0.0001)极为显著,而失拟性检验不显著(p=0.2118>0.05),说明所选用的二次回归模型与实验具有良好的拟合度。模型的决定系数R2=0.9977,说明该方程与实际情况相符,可以充分反映各因素与响应值的真实关系;由自变量F值大小可知,各因素对反式叶黄素提取量的影响由大到小依次为:超声功率>液固比>提取时间,说明在超声提取过程中影响反式叶黄素提取量的首要因素是超声功率,这与前人[31]研究结果一致。也有学者认为[32],超声时间对叶黄素提取效果影响最大,其次是液固比,超声功率影响最小,这可能与提取原料特性有关。

从表4还可看出,叶黄素顺式异构体提取量的回归模型达到极显著水平(p<0.0001),失拟项不显著(p=0.4077>0.05),决定系数R2=0.9440,说明模型与实际的实验拟合很好;由自变量的p值可知,模型的一次项x1、x2差异极显著(p<0.0001),交互项x2x3显著(p<0.05),其他项差异不显著,这说明各影响因素对叶黄素顺式异构体提取量的影响不是简单的线性关系。由自变量F值大小可知,影响叶黄素顺式异构体提取量的首要因素是超声功率,其次是提取时间,液固比对其影响最小。

表3 响应面分析实验设计及结果Table 3 Experimental design and results of response surface

注:叶黄素顺式异构体提取量为9-顺式-叶黄素、9′-顺式-叶黄素、13/13′-顺式-叶黄素及15-顺式-叶黄素提取量之总和。

表4 回归方程模型系数的显著性检验Table 4 Significance of each coefficient in the fitted regression model

注:“*”为差异显著(0.01

2.4.2 最佳工艺条件的验证 利用Design Expert 软件的优化功能,在回归模型的基础上获得的最佳工艺为:超声功率209 W,提取时间30 min,液固比40∶1 mL/g,考虑到实际的可行性和便利性,修正提取工艺为:超声功率210 W,提取时间30 min,液固比40∶1 mL/g,在此条件下反式叶黄素及其叶黄素顺式异构体的提取量预测值分别为239.1 μg/g dw和9.1 μg/g dw。对此工艺进行三次平行验证实验,得到反式叶黄素的实际提取量为(229.7±9.1) μg/g dw,叶黄素顺式异构体实际提取量为(9.4±0.2) μg/g dw,与优化方案的理论值相比,相对误差分别为3.9%和3.3%,说明模型可靠。

3 结论

本研究采用超声波法提取南瓜皮中的叶黄素,确定了南瓜皮叶黄素提取的最佳溶剂为乙醇-石油醚(2∶1,V/V),南瓜皮叶黄素提取物中共鉴定出1种反式叶黄素和4种叶黄素顺式异构体(9-顺式叶黄素,9′-顺式叶黄素,13/13′-顺式叶黄素,15-顺式-叶黄素)。在单因素实验基础上,通过中心组合实验设计及响应面模型优化,确定了超声波法提取南瓜皮叶黄素的最佳工艺条件:乙醇/石油醚体积比2∶1、液固比40∶1 (mL/g)、超声功率210 W、提取时间30 min,在此条件下反式叶黄素提取量为(229.7±9.1) μg/g dw,与优化方案的理论值相近,模型可靠。

此外,研究结果表明,超声功率对叶黄素提取量的影响较大,高功率超声波能促进叶黄素溶出,但功率过大会导致反式叶黄素异构化;而长时间超声产生热量积聚也可能导致反式叶黄素发生氧化降解。

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