活化T细胞核因子与肿瘤生物学行为的研究进展①

许 洋 张雅敏

(天津市第一中心医院肝胆外科，天津 300192)

活化T细胞核因子(Nuclear factor of activated T cell,NFAT)最初作为与人T细胞中白介素-2(IL-2)启动子的抗原受体应答元件-2(ARRE-2)相结合的诱导型核因子被发现[1]。随后的一系列研究表明，NFAT不仅仅在T细胞中表达，而且在哺乳动物的各种免疫细胞和非免疫细胞中均存在普遍表达，其在细胞周期、胚胎发育和器官发生(特别是心脏、造血、骨骼和神经元系统)中起到多重调节作用[2,3]。

NFAT信号传导的失调与肿瘤恶性表型和肿瘤进展有关。目前已经了解到在人体实体肿瘤和血液恶性肿瘤中存在着过表达的和/或持续激活的NFAT[4]。 事实上，NFAT转录因子已显示出能调节肿瘤的发生发展并在细胞的增殖、分化、侵袭、转移、血管形成和肿瘤微环境中起重要作用。 因此，了解NFAT在肿瘤生物学行为中的作用将有助于寻找针对恶性肿瘤中NFAT相关途径的安全有效的治疗方式。

1 NFAT简介

NFAT家族包含5个成员，包括4个钙离子调控型，分别为NFAT1(NFATc2或NFATp)，NFAT2(NFATc1或NFATc)，NFAT3(NFATc4)和NFAT4(NFATc3或NFATx)，以及渗透压反应增强子结合蛋白(TonEBP，也称为NFAT5)[5]。除了NFAT5，其他4个成员通过PLC-γ途径或通过Ca2+持续内流而被活化，钙离子调控型NFAT(NFAT1-NFAT4)在胞质中处于高磷酸化状态，当细胞内钙离子水平升高，钙离子结合钙调蛋白，从而活化钙调神经磷酸酶，活化的钙调神经磷酸酶(CaN)使NFAT去磷酸化而向核内易位，与DNA相关位点结合从而发挥转录调节作用[6]。

所有的NFAT蛋白都存在高度保守的REL同源区(RHD)，该区域在结构上与核因子-κB(NF-κB)家族的DNA结合区很相似，且该区域使NFAT蛋白具有DNA结合特异性。此外，NFAT同源区(NHD)为NFAT蛋白(NFAT1-4)存在的另一种高度保守的同源区，其位于RHD的氨基端，其中含有丰富的丝氨酸残基，在静息状态下，丝氨酸残基高度磷酸化,使NFAT对DNA的亲和性降低；当静息状态的细胞被多种因子激活后，钙调神经磷酸酶与此区域结合并激活调节区，使得大量丝氨酸残基去磷酸化而处于活化状态，调节NFAT向核内的易位[7]。N末端同时存在其他的调控区，如反式激活区(TAD)、钙调神经磷酸酶停靠区(CDS)、核定位序列(NLS1、NLS2)及出核信号区(NES)等，它们起到控制NFAT亚细胞群在核内的定位作用。由于NFAT5只保留RHD，并没有保留CDS，其不能与钙调神经磷酸酶结合而发挥转录活性作用。

2 NFAT与肿瘤的发生发展

肿瘤的发生主要为致癌因素长期的作用导致基因突变，使得正常的细胞受到正性生长信号的持续刺激或者细胞凋亡受阻。NFAT蛋白存在着潜在的致癌性，其通过参与调控细胞周期、细胞的增殖与分化、细胞运动和血管生成而调控着肿瘤的形成[8]。目前，很多研究发现，NFAT家族成员在几种恶性肿瘤中均存在着持续激活或过表达，如对于胰腺癌的研究中，Singh等[9]发现在致癌信号的调控下，正常胰腺细胞经历上皮-间质转化(EMT)过程，从而具有多重分化的干细胞样特点，而活化的转录因子NFAT2为胰腺肿瘤细胞发生相关肿瘤行为的重要调控因子，NFAT2通过依赖干细胞因子Sox-2转录来调控EMT的基因编码并将胰腺肿瘤细胞维持在干细胞样状态。然而，并非所有NFAT蛋白均具有致癌性，Robbs等[10]发现激活的NFAT1蛋白通过Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路而抑制肿瘤的发展，并提出通过以NFAT1为靶点，从而调控其下游信号的激活或抑制的基因治疗。在成纤维细胞中,活化的 NFAT1能够引起细胞周期阻滞和凋亡,抑制细胞转化，然而活化的 NFAT2却增加其增殖与转化，这一切可能是因为不同细胞类型表达不同的NFAT的表型，在成纤维细胞中NFAT2为其主要表型，但在人角质形成细胞中NFAT1为主要表型。

3 NFAT与肿瘤的增殖及恶性转化

肿瘤的形成是一个长期发展的过程，在外界因素及遗传因素的作用下，细胞发生接触抑制丧失，生长失去控制，核异常等，从而转变成具有恶性生长特性及功能的细胞。很多研究正在揭示NFAT转录因子在细胞的增殖及恶性转化的多方面的作用。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)在CD4及CD8 T细胞中存在着差异性表达，在CD4及CD8 T细胞中，NFAT1蛋白与CTLA-4的近端启动子结合，促进CTLA-4蛋白的转录活化，其活化抑制CD4及CD8 T细胞的增殖分化；在激活的CD4 T细胞中，其内NFAT1蛋白的表达明显增强，NFAT1的过表达增加了CTLA-4的表达，从而抑制T细胞的增长，然而NFAT2却并没有与CTLA-4结合的能力[11]。 在对乳腺癌的研究中发现，NFAT蛋白的调控失调与细胞的增殖及恶性转化紧密相关。虽然MDM2-P53通路已经在肿瘤通路中被证实，但是近来发现MDM-2可为肿瘤发生的独立因素。Qin研究证实[12]，无论是体外试验还是体内实验，在人类的恶性肿瘤中，MDM-2的启动子存在相关位点，NFAT1转录因子能与此位点结合，促进MDM-2的活化转录，促进细胞的增殖与分化，抑制细胞的凋亡；当使用Inulanolide A抑制NFAT1的表达时，MDM-2的表达量明显降低，并与之存在剂量依赖关系。故可以此为基础，探索NFAT1在恶性肿瘤的增殖、转化中扮演的角色及发挥的作用。

在干细胞由静息状态转变为增殖状态的过程中，NFAT2起到了关键性的作用。作为静息干细胞内骨形成蛋白4(BMP4)的下游转录因子，NFAT2能有效抑制免疫检查点激酶(如CDK4)，使干细胞维持在稳定的静息状态。另一方面，肿瘤细胞可以通过NFAT获得干细胞样的功能，从而具有干细胞样自我更新的能力，促进自身的增殖及转化[13]。

4 NFAT与肿瘤的浸润及转移

恶性肿瘤细胞具有向周围组织侵袭和向远处组织转移的能力，即浸润和转移，转移的发生以浸润为前提，其转移通常侵犯破坏受累器官和组织，引起重要器官功能衰竭并导致死亡。NFAT蛋白在肿瘤的浸润及转移过程中扮演着重要的角色。整合素是一种介导细胞和其外环境(如细胞外基质)之间的连接跨膜受体，参与了细胞信息、细胞周期的调节、细胞形态以及细胞的运动，对细胞和细胞外基质的黏附起介导作用。在肿瘤细胞当中，半桥粒释放整合素α6β4，其与肌动蛋白的细胞骨架相互结合，并激活了下游NFAT5的转录活化，通过级联反应激活下游靶点COX-2，促进了肿瘤细胞的转移。究其原因，可能是COX-2的活化促进了前列腺素E2的合成，而前列腺素E2为促进细胞转移的有效促分裂原[14]。除了COX-2途径外，NFAT同时能诱导上皮细胞中侵袭性基因如自体毒素基因的转录。在人角质化细胞中，自体毒素介导溶血磷脂酰胆碱向溶血磷脂酸(LPA)的转化，促进了细胞的浸润及转移[15]。动物模型研究发现，在小鼠体内注射活化的NFAT乳腺癌细胞(实验组)及干扰NFAT基因的乳腺癌细胞(对照组)2周后，实验组小鼠肺中发现大量的癌转移灶，证实NFAT1及NFAT2对于肿瘤的转移起到关键作用[16]。虽然NFAT的转移作用在乳腺癌及胰腺癌中得到大量的实验证实，但NFAT的其他通路机制还有待进一步的研究。

5 NFAT与肿瘤的血管生成

肿瘤转移最常见的途径为经血管转移。除了为肿瘤的增殖分裂提供必需的营养物质及氧，新生的肿瘤血管也为肿瘤转移提供了必要通路。新生血管的结构不规则性、血液流动学的变化以及高通透性均为肿瘤的转移提供了条件。现已发现一些因子与肿瘤血管生成有着紧密的关系，如血管内皮生长因子A(VEGFA)、成纤维细胞生长因子(a-FGF/b-FGF)、分泌型卷曲相关蛋白2(SFRP2)等。NFAT 的血管生成作用在 Nfat3/Nfat4 缺陷和在钙调磷酸酶 B(Cnb1)基因敲除的小鼠身上被首次证明[17]。缺乏 Cnb1 或Nfat3/Nfat4 基因的老鼠，由于 VEGF异位表达造成的血管紊乱而死于妊娠中期。同时VEGF 促进 PLCγ受体介导的激活，增加细胞内钙水平，从而激活钙调磷酸酶引起 NFAT 核易位。核 NFAT 易位促进血管生成基因如COX-2 的转录，从而使PGE2 的合成增加。作为外源性钙调神经磷酸酶抑制剂，他克莫司(FK506)及环孢素(CsA)在上皮细胞中对于VEGF-COX2致使血管生成的通路抑制作用已被证实，而作为NFATs 内源性抑制剂，如 DSCR1，也是强大的肿瘤血管生成抑制剂。之前的相关研究发现，在乳腺癌中SFRP2存在着过表达现象，其表达与NFATc3存在着正相关关系，而他克莫司抑制NFATc3的表达从而抑制乳腺癌细胞的增殖增生[18]。所有这些发现都强调 NFAT 蛋白在血管生成中的调控发挥了主要作用。

6 NFAT与肿瘤微环境

肿瘤微环境是指肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等与肿瘤细胞共同构成的局部内环境，这其中包括许多健康的细胞。炎症趋化因子通常在恶性肿瘤中高表达，其通过促进上皮细胞的趋化及迁移而表现出侵袭性。NFAT蛋白与炎症趋化因子活性密切相关，可能在肿瘤微环境中起到重要作用。NFAT转录因子通过调节淋巴细胞产生的白细胞介素和IFN-γ的表达来维持趋化因子和细胞因子之间的平衡，从而影响促肿瘤及抗肿瘤反应[19]。NFAT蛋白的过度激活，可通过使浸润性巨噬细胞分泌EGF、集落刺激因子1(CSF1)及肿瘤细胞过表达表皮因子生长受体(EGFR)，从而形成旁分泌信号循环，而促进肿瘤细胞的转移。在缺乏NFAT1的情况下，减少IL-4及TGF-β的表达，可观察到肿瘤增殖能力的下降，从而证实NFAT1通过调节肿瘤微环境而具备有促进肿瘤增殖的能力[20]。

7 总结与展望

随着研究的深入，激活的NFAT在肿瘤细胞中增殖转化、浸润转移、血管生成的作用正被逐渐认识到，其在肿瘤生物学行为中扮演着重要的作用。如我们所知，不同的NFAT亚型，在不同细胞的增殖及发展过程中起到不同的作用，一种NFAT可能在一种细胞中抑制其增殖，而其相关亚型可能会促进其发生发展。所以，当前亟待解决的问题是相关动物模型的建立及应用。由于NFAT亚型间的功能既相互独立又相互联系，敲除单个NFAT亚型的小鼠很难出现特异的表现型，而敲除多个亚型时，由于免疫紊乱而限制了对肿瘤进展的评估，所以目前的研究大多限制在体外实验中。未来构建的动物模型应该是，特定的细胞或特定的细胞微环境中的NFAT被特异性敲除或过表达，而且能检测到明确的具有代表性的指标。同时NFAT家族与炎症的发生也密切相关，相关炎症因子在肿瘤的浸润转移中也发挥了相关作用，所以探究NFAT与促炎症发生的相关信号通路，对于多模式多通路机制治疗的发展也有重要意义。

目前已知的NFAT的激活有赖于CaN-NFAT通路，因此有效阻滞细胞内钙离子的释放及细胞外钙离子的内流将有助于抑制NFAT的激活，从而抑制其介导的肿瘤细胞的相关生物学特性。目前除了FK506、CsA能有效抑制NFAT蛋白激活外，地高辛也被发现能有效抑制NFATc2与c-Myc间的相互作用而促进肿瘤细胞的凋亡[21]。故以NFAT为出发点，研究NFAT激活致肿瘤发生发展的各信号通路中相关位点的作用，以其为靶点研制新型具有抗癌作用的药物，将为肿瘤的治疗提供更多的参考价值及研究方向。

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