分子对接技术在中药抗炎活性成分筛选和作用机制研究中的应用

朱锐灵，沈 悦，马飞鸿，刘 鹏，汤 建，

（1.江苏大学药学院，江苏镇江 212013；2.亳州学院中药学院，安徽亳州 236800）

中药是我国几千年来传承下来的瑰宝，因多组分、多靶点、多途径起效的特点使其在治疗炎症，特别是在顽固性的慢性炎症方面有着独特的优势。但是，受研究思路和实验条件的限制，目前抗炎中药的药效物质和相关作用机制的研究面临诸多困难［1］。计算机辅助药物设计（computer aided drug design）具有直观、合理和便捷等特点，药物研究领域得到广泛使用，并逐渐成为中药与现代化进程连接的桥梁。其中，分子对接（molecular docking）技术在中药活性成分的虚拟筛选和确定作用靶标等方面已成功运用并展现出独特的优势［2］。本文就分子对接技术在中药抗炎活性成分筛选及抗炎靶标确定方面的应用进行综述，以供后续研究借鉴。

1 分子对接的含义

分子对接是通过化学计量学方法模拟分子的几何匹配和能量匹配，来寻找小分子（配体）与生物大分子（受体）之间最佳结合模式的过程，包括刚性对接、半柔性对接以及柔性对接［3］。对接中常采用半柔性对接，指对接过程中受体是刚性而配体是柔性（可在一定范围内变化）。它兼顾计算量与模型预测准确性两方面的优点，被广泛应用于小分子和大分子间的对接。常用的软件有AutoDock，Dock和Sybyl等。

针对某一特定的靶标蛋白，利用相关软件对中药化合物库进行虚拟筛选，寻找与靶蛋白结合密切的候选化合物，再进行生物活性测定，最终筛选出具有活性的化合物。分子对接作为一种高效的辅助筛选手段，在中药有效物质基础研究方面有着广泛的应用前景。

2 分子对接在中药抗炎活性成分筛选中的应用

炎症是机体对感染或组织损伤作出的天然防御机制是一个复杂的病理过程。炎症介质指的是炎症过程中形成、释放并参与炎症反应的活性物质，常见的炎症介质包括炎症细胞因子〔肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素（inter⁃leukin，IL）、干扰素（interferon，IFN）和集落刺激因子等〕、脂类炎症介质〔花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代谢物等〕、胺类炎症介质（组胺和5-羟色胺等）、自由基类物质及黏附分子等［4］。

2.1 以炎症细胞因子为靶标的中药活性成分筛选分子对接

细胞因子是机体的免疫细胞和非免疫细胞经刺激而合成和分泌的小分子蛋白质，能调节多种细胞生理功能。TNF-α参与多种炎症的信号通路，而且可以调节其他细胞因子的合成和释放。IL家族（如IL-6和IL-8）是由活化的单核-巨噬细胞及淋巴细胞等产生的一类细胞因子，参与炎症反应的部分或者全过程。IL-6主要是刺激免疫细胞的增殖和分化，参与机体的免疫应答，进而增加炎症反应。IL-8是巨噬细胞和上皮细胞分泌细胞因子，能刺激机体中的中性粒细胞和淋巴细胞等发生趋化、脱颗粒，释放一系列活性物质，导致机体产生炎症反应。在炎症的病理检查中，发现大量的炎症细胞。一些细胞因子如IL-1，IL-6，IL-8和TNF-α等促进了炎症细胞的聚集和活化及炎症介质的释放。研究发现，在大多数炎症中可检测到上述某些细胞因子的水平升高［4］。

沈霞等［5］以细胞因子IL-6为研究靶点，采用AutoDock 4.2软件进行分子对接筛选连翘中抗炎的化学物质。从中药系统药理学数据库TCMSP2.0（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中选取150种连翘化学成分，PDB数据库（http：//www.rcsb.org/pdb）下载IL-6的复合物三维结构。软件对接结果显示，74种成分与靶蛋白IL-6的结合能优于原配体L-酒石酸与IL-6的结合能-3.8 kcal·mol-1。得分排序前三的是五环三萜类化合物：桦木酮酸（betulonic acid）、桦木酸（betulinic acid）、齐墩果酸（oleanolic acid）。分子对接的结果与前期药理活性数据具有一致性：齐墩果酸和桦木酸具有显著的抗炎活性，对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的U937细胞产生的IL-6抑制率分别为86.9%和80.2%［6］。桦木酮酸也具有明确的抗炎活性，能够有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和 PGE2水平［7］，这说明基于AutoDock分子对接虚拟筛选IL-6抑制剂具有一定的准确性。

郑春松等［8］利用计算机模拟方法研究中药羌活治疗骨关节炎（osteoarthritis，OA）的活性成分。在查阅相关文献和检索治疗靶数据库（Therapeutic Target Database）的基础上，确定IL-1β，IL-6，TNF-α和iNOS为治疗OA疼痛的靶点，在PDB中下载其含配体的蛋白质复合物晶体结构。在北京大学天然产物库（http：//pkuxxj.pku.edu.cn/UNPD）下载96个羌活化学成分结构，利用Discovery Studio（DS）中的LigandFit模块进行分子对接：删除蛋白质结构的溶剂和配体，加氢，寻找活性位点，配体进行力场优化。对接后采用DOCK-SCORE排序，分值高于原配体的化合物被视为羌活抗炎镇痛的活性成分。利用Cytoscape软件绘制羌活活性成分和炎性靶点作用网络图，发现羌活抗炎镇痛的关键靶点是IL-1β，IL-6和TNF-α，且与靶点结合的主要活性成分是香豆素苷类化合物：香柑酚-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（bergaptol-O-β-D-glucopyranoside）、秦皮苷（fraxoside）、6′-O-E-阿魏酰紫花前胡苷（6′-OE-feruloylnodakenin）、5-甲氧基补骨脂素-8-O-β-D-葡萄糖（5-methoxy-8-O-β-D-glucosyloxypso⁃ralen）。前期的药理活性实验发现，秦皮苷（1 mg·L-1）对LPS诱导的RAW246.7细胞中IL-1α的抑制率为47.1%，是秦皮重要的抗炎活性成分［9］，在一定程度上证明分子对接结果与羌活抗炎活性数据具有一致性，这为从羌活中开发治疗OA的新药提供了依据。但目前尚无香柑酚-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和5-甲氧基补骨脂素-8-O-β-D-葡萄糖苷的抗炎活性报道和上述香豆素苷类化合物对潜在作用靶点IL-1β，IL-6和TNF-α的系统研究，还需进一步的药理实验对上述对接结果进行验证。

Yadav等［10］利用分子对接软件Scigress Explorer考察沉香木油中的化合物与炎症靶标IL-1，IL-6，TNF-α和环氧合酶1（cyclooxygenase-1，COX-1）的结合能力。结果表明，化合物沉香螺旋醇（agaro⁃spirol），沉香雅槛蓝醇（jinkoh-eremol）和茅苍术醇（hinesol）比沉香木油中其他化合物有更强的结合力，表现出较好的抗炎潜力。在12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）致炎的小鼠模型中，与空白对照组相比，沉香木油剂量依赖性地降低TPA引起的耳肿胀和升高的丙二醛水平，同时也降低促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平，进一步表明了分子对接的有效性与可靠性。

刘旭等［11］以苦参碱为配体，将其与6个炎症因子（TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6，COX-1和COX-2）受体分子对接，发现苦参碱与TNF-α受体结合得分最高。依据对接结果和药物拼接原理，从美国癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）数据库中筛选出可用于拼接的小分子化合物（活性基团），以苦参碱为母体设计了4077个新衍生物，MOE软件分子对接，发现其中98个衍生物的得分高于苦参碱的对接得分。综合考虑类药性及实际合成的可行性，制备了其中19个与TNF-α受体对接结合分值较为优异的衍生物。在小鼠炎症模型中，有4个化合物对耳肿胀抑制效果强于苦参碱；有6个化合物对足肿胀抑制效果强于苦参碱，其中3个化合物对两项指标的作用强度均高于苦参碱。这说明分子对接技术在设计活性衍生物方面具有良好的指导作用，但与实际药理实验结果仍有一定的差异，需要在后续的实验中修正相关参数，进一步提高准确度。

2.2 以花生四烯酸代谢途径为靶标的中药活性成分筛选分子对接

AA是不饱和脂肪酸，主要存在于细胞膜磷脂中。当机体受到刺激时，生物膜上的磷脂酶被激活，促使大量的AA从膜磷脂中被释放，游离的AA主要通过COX和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）参与的两条代谢途径，生成与炎症相关的前列腺素（prostaglandin，PG）类代谢物和产生白三烯（leukotriene，LT）类代谢产物［12］。

大黄、羌活和秦艽有着确切的抗炎活性，3味药材组成的中药化学成分库包含了400多个小分子化合物。利用DS 4.0中的Hiphop模块构建靶标抑制剂药效团模型，筛选3味中药的化学成分库，获得5-LOX和LTA4H潜在活性成分。DS 4.0和CDOCKER模块进一步筛选药效团初筛所得成分，考虑药效团匹配值、分子对接得分值和分析配体与受体之间的相互作用力，确定大黄中的revandchi⁃none 4、羌活中的二十三烷酸和二十四烷酸以及秦艽中的褐煤酸甲酯这4个成分为靶标5-LOX和LTA4H的双效抑制剂［13］。一些含有脂肪酸的亲脂性成分具有良好的抗炎活性，如从2种海兔中提取的含有二十三烷酸、二十四烷酸的脂溶性部位对LPS诱导的RAW264.7细胞中的iNOS和LOX具有显著的抑制作用［14］。但目前尚无关于上述单体化合物的详细的抗炎活性和分子机制报道，对于分子对接结果，还需要进一步的药理实验进行验证。

为分析银翘解毒软胶囊的主要活性成分，从数据库中检索该方9味中药得到1053个化合物分子，采用Cerius 2，DS 2.5和AutoDock 4.0软件优化处理配体和受体，完成分子对接。分析对接数据发现，羽扇豆醇（lupeol）、豆甾醇（stigmasterol）和甘草次酸（glycyrrhetinic acid）等95个化合物与16个呼吸道感染靶蛋白有较强的相互作用，进而推测这些分子可能是该药治疗疾病的活性成分［15］。分子对接结果中关于羽扇豆醇和豆甾醇的描述与前期的药理实验结果具有一致性：在LPS致炎的小鼠模型中，羽扇豆醇对小胶质细胞的活化状态和升高的TNF-α，iNOS和IL-1β水平具有显著的抑制作用［16］；羽扇豆醇对TPA诱导的CD-1小鼠上皮组织中的iNOS和COX-2蛋白表达亦有明显抑制作用［17］。豆甾醇明显降低LPS诱导的COX-2和iNOS的mRNA水平，减少PGE2和NO的释放［15］。甘草次酸对LPS诱导的RAW264.7细胞有确切的抗炎活性，能显著抑制iNOS和COX-2蛋白表达和相应的mRNA水平［18］，但是在文献［15］的分子对接结果中，甘草次酸并不是“药-靶网络图”中网络度和介数较高的26个活性成分之一。这种不一致可能是因为分子对接中圈定的靶点并不是甘草次酸的真正结合位点。文献［15］中网络度最高的2个化合物3β-羟基-20-蒲公英萜烯（20-taraxaster-3β-ol）和蒲公英甾醇（taraxasterol）结构相似，区别是前者双建存在于20（21）位，而后者双键存在于20（30）位。蒲公英甾醇具有显著的抗炎活性［19］，这与分子对接结果高度一致，鉴于二者结构相近和分子对接结果，推测3β-羟基-20-蒲公英萜烯也具有抗炎活性，但该化合物在植物中含量较低，缺少相关的药理活性报道。

车前草具有清热利尿和抗炎的活性，但对其抗炎机制研究较少。为研究车前草的活性成分的抗炎机制，选择3种具有不同小分子配体的COX-2复合物（PDB ID：1CX2，1PXX，4COX）为靶点，应用分子对接方法（Sybyl-X 1.1）筛选出车前草中34种小分子化合物，排名前7的抗炎活性成分依次是桃叶珊瑚苷（aucubin）、车前草苷B（plantainoside B）、阿魏酸（ferulic acid）、6-羟基木犀草素（6-hydroxyluteolin）、芹菜素（apigenin）、京尼平苷酸（geniposidic acid）和梓醇（catalpol）［20］，这与报道的药理实验结果具有一致性。桃叶珊瑚苷（10 μmol·L-1）对IL-1β诱导的软骨细胞中的iNOS和COX-2蛋白含量的抑制率分别为40%和25%，同时显著抑制基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）和MMP-9表达［21］。阿魏酸（100 μmol·L-1）对LPS/IFN-γ诱导的RAW264.7细胞中iNOS有显著的抑制活性，对COX-2也表现一定的抑制作用［22］。芹菜素能够显著抑制LPS诱导的BV-2细胞中COX-2，COX-1和iNOS蛋白表达，对p38和JNK等酶的磷酸化也具有良好的抑制作用［23］。京尼平苷酸（100 mg·kg-1）对AA大鼠足肿胀程度有明显得抑制作用，对血清中的TNF-α和IL-1β的抑制率为28.0%和21.7%［24］。梓醇显著抑制LPS/IFN-γ共同诱导星形胶质细胞炎症基因iNOS，COX-2和Toll样受体4（Toll-like receptor4，TLR4）的表达，降低NO和活性氧的生成［25］。这表明利用分子对接技术发现车前草的抗炎活性成分具有较高的可行性。

曾茂贵等［26］利用分子对接法探讨扶正抑瘤复方制剂对COX的作用。下载COX-1（PDBID：1PGG）和COX-2（PDB ID：6COX）晶体结构，利用Gerius 2软件处理受体：去溶剂、去配体、加氢；同时对配体—该复方制剂中230个化学成分进行力场优化、加电荷等。LiganFit模块进行分子对接、打分，筛选出分值高于原配体的化合物。发现与COX-1和COX-2结合较好的化合物分别有22个和7个，其中木犀草素（luteolin）、芹菜素、槲皮素（quercetin）和二氢赤松素（dihydropinosylvin）等化合物同时抑制COX-1和COX-2，揭示复方制剂可能通过协同作用抑制COX发挥抗炎活性。药理实验发现，木犀草素（80 mg·kg-1）可抑制角叉菜胶致炎的大鼠足爪肿胀，显著降低足炎症组织PGE2生成，并显著抑制COX-2蛋白表达［27］。槲皮素也具有广泛的抗炎活性，对痛风性关节炎模型大鼠血清和滑膜中炎症因子IL-1β，TNF-α和COX-2蛋白水平具有显著的抑制作用［28］。

Saranya等［29］以5-LOX 和COX-2为靶点，与近海植物中常见的4种活性化合物金合胞酮O（agal⁃lochaol O）、桦木酸、含羞草醇D（mimosol D）和丁香酚（eugenol）进行分子对接。结果显示，4个配体在5-LOX和COX-2的活性位点都有较好的结合，表明化合物通过对5-LOX和COX-2的抑制，阻止AA的代谢而发挥抗炎作用。一定程度上，分子对接结果得到前期药理实验的支持。前期实验中发现桦木酸有显著的抗炎活性［6，30］，ELISA法测定其抑制COX-1和COX-2活性的IC50分别为115和11.4 μmol·L-1。金合胞酮O（100 μmol·L-1）对LPS诱导的RAW264.7细胞中的IL-6和TNF-α的抑制率分别是52.6%和44.5%，对NF-κB也具有一定的抑制作用；含羞草醇D对LPS诱导的RAW264.7细胞中的NO和TNF-α的IC50分别是3和6.5 μmol·L-1；丁香酚（2 μmol·L-1）对LPS诱导的RAW264.7细胞中COX-2和PGE2具有显著的抑制作用，对COX-2 mRNA水平也有明显抑制作用［31-32］，对多形核粒细胞中的5-LOX和L6TC4的 IC50分别是 26 和 30 μmol·L-1［33］。这说明分子对接技术在虚拟筛选COX-2抑制剂方面具有较高的“命中率”，能有效协助抗炎化合物库的建立和筛选。

中药黄芩对阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）有一定的疗效，其活性机制涉及到对COX的抑制。为解析黄芩化学成分与COX的相互作用，给治疗AD提供一定理论依据，马宏跃等［34］采用软件Molegro Virtual Docker（MVD）预测配体和受体的相互作用，并根据配体预测大分子蛋白的活性位点。从PDB数据库下载COX-2复合物三维结构（PDB ID：6COX），用MVD分析其活性位点。将黄芩中4种主要黄酮类成分黄芩苷（baicalin）、汉黄芩苷（wogonoside）、黄芩素（baicalein）和汉黄芩素（wogonin）与COX-2对接，分析结合位点和打分值，发现苷类（黄芩苷和汉黄芩苷）比苷元类（黄芩素、汉黄芩素）的有着更高的抑制活性，因为苷中糖片段作用于活性口袋的S2位点，增加了结合力。这4个黄酮类化合物都有良好的抗炎活性，20 μmol·L-1的黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对LPS诱导的RAW 264.7的NO释放和iNOS活性有着显著的抑制作用，且黄芩苷的活性略高于黄芩素；汉黄芩素显著抑制COX-2活性，但黄芩苷和黄芩素对COX-2的抑制作用较弱［35-36］。分子对接结果与药理实验具有一定程度的一致性，能够为黄芩治疗AD的可行性和机制提供一定的研究依据。

Honmore等［37］从高良姜中分提取分离得到的高良姜精（galangin）和5-羟基-7-（4"-羟基-3"-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮的化合物，将其与COX-2对接，显示出较好的结合力。该结果得到前期药理数据的支持：高良姜精（5 μmol·L-1）对LPS诱导的J774A.1细胞中COX-2和iNOS的抑制率分别为58.6%和60.3%，对NO和PGE2的释放也具有显著抑制活性［38］，这一定程度上证实了分子对接结果的可靠性。

刘培勋课题组［39］基于计算机辅助药物设计方法探讨黄连解毒汤抗炎药效物质基础，从数据库中检索黄连解毒汤组方药材黄连、黄芩、黄柏和栀子的化学成分，共计222种。针对炎症靶点COX-2，IKK-2和PDE-4等受体，将受体与配体进行分子对接，按照分值高低排序，筛选活性较优的化合物。其中10-乙酰京尼平苷（10-acetylgeniposide）、红景天苷（salidroside）、藁本内酯（Z-ligustilide）、汉黄芩素-5-β-D-葡萄糖苷（wogonin-5-β-D-glucoside）和芦丁（rutin）等28个小分子化合物同时抑制2～3个靶标蛋白，特别是10-乙酰京尼平苷和红景天苷对3个靶标均呈现明显抑制作用。上述分子对接结果的一部分在药理实验中得到了验证：藁本内酯能够有效抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中iNOS和COX-2的表达和相应的mRNA水平［40］。在血管性痴呆大鼠模型中，红景天苷对海马区COX-2和NF-κB表达有显著抑制作用［41］。该课题组还研究了中药血必净抗炎作用药效物质基础和多靶点作用［42］。从中药与有效成分数据库检索血必净复方中的化学成分，同源建模得到炎症靶点5-LOX的三维结构，利用Sitemap确定活性位点，Glide模块将小分子配体与炎症靶点5-LOX和COX-2对接和建立IKK-2的抑制活性药效团，筛选血必净中的活性成分。分析发现，血必净化学成分中与靶点5-LOX，COX-2和IKK-2结合效应较好的小分子化合物分别有30，36和8个。其中16个分子对靶点5-LOX和COX-2有较好的结合效应，特别是迷迭香酸（rosmarinic acid）对3个靶点均有明显结合能力，具有潜在的双（多）重抑制作用。迷迭香酸对人和小鼠的炎症症状具有显著的抑制作用，对于TPA致炎的小鼠耳组织COX-2蛋白和mRNA有显著的抑制作用［43］。上述两个例子都从分子层次上阐释了中药复方的药效物质基础和多靶点作用效应，为中药复方的临床应用提供科学依据，也为寻找新型抗炎药物提供一定的参考和借鉴。

2.3 以其他炎症介质为靶标的中药活性成分筛选分子对接

Mann 等［44］研究可食性木奶果（Baccaurea sapida）的药用活性成分，并用分子对接技术预测其对类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）的抗炎活性成分。质谱鉴定出木奶果中的10种化合物，其中6种化合物：水杨酸（salicylic acid）、芥子酸（sinapic acid）、槲皮素、杨梅素（myricetin）、对香豆酸（p-coumaric acid）和绿原酸（chlorogenic acid）具有一定的抗炎活性。金黄色葡萄球菌表面蛋白A（staphylococal protein A，SPA）是引发RA的重要因素，使用AutoDock软件对接6种抗炎化合物和SPA，发现槲皮素对SPA的抑制常数为47.01，结合能为-5.90 kcal·mol-1，是最有潜力的基于SPA抑制的抗炎化合物。这提示木奶果的甲醇提取物具有显著的抗炎潜力。

郑春松［45］采用分子对接技术研究独活寄生汤治疗OA的药效物质基础及作用靶点。检索独活寄生汤组方药材的化学成分，构建独活寄生汤化学成分库。选取已经明确的OA治疗靶点蛋白聚糖酶1和2（ADAMTS-4和5）、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、COX-2、IKK-β和5-LOX为受体，在LigandFit模块中进行分子对接，DOCK-SCORE打分筛选出独活寄生汤的药效成分264个。其中184个化合物可以同时抑制2个及以上靶蛋白，如异洋丁香酚苷（isoacteoside）能 与 MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-8，MMP-9，MMP-11，MMP-13，5-LOX 和IKK-β有较好的作用，丁子芽鞣素（eugeniin）能与MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-11，IKK-β和5-LOX有较好的作用，绿原酸能与MMP-1，MMP-3，MMP-8，MMP-9，MMP-13和IKK-β有较好的作用。药理实验发现，异洋丁香酚苷（80 μmol·L-1）具有确切的抗炎活性，能显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中的TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2，iNOS，COX-2和iNOS的mRNA水平，降低磷酸化IKKα/β含量，并有效阻滞LPS诱导的HEK293T细胞中TLR4的二聚化进程［46］；体外实验中，丁子芽鞣素（30 μmol·L-1）对 HT1080 细胞中的 MMP-2和MMP-9抑制作用显著，IC50分别为9.0和82 μmol·L-1［47］；绿原酸（20 μmol·L-1）具有确切的抗炎活性，显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞中的MMP-1，MMP-3和MMP-13的mRNA水平，提高基质金属蛋白酶抑制物-1 mRNA水平，对NF-κB的激活状态和IκBα的降解具有显著的抑制作用［48］。绿原酸（每只5.7 mg）对TPA致炎的小鼠上皮细胞中的iNOS，COX-2和IKK-β表现出显著的抑制作用，并有效抑制IκBα的降解［49］。部分分子对接结果得到前期药理实验数据的支持，这说明分子对接技术在预测独活寄生汤药效成分和解释多靶标作用机制方面具有较高的可行性，有良好的应用前景。

3 反向分子对接在中药抗炎活性成分作用机制研究中的应用

反向对接技术是指以分子对接技术为基础，将单一或者多个配体活性化合物作为研究对象，对数据库中大量的蛋白受体进行对接筛选，按照对接能量高低排序并分析，找到潜在的靶蛋白。该技术可以确定生物活性已知的小分子化合物作用的潜在靶蛋白，进而为解析其作用机制提供新思路［50］。

中药成分奇任醇（kirenol）对RA有确切的疗效，显著抑制佐剂性关节炎大鼠的足肿胀，提高大鼠脾细胞的增殖能力，降低CD4+T细胞比例，抑制二甲苯所致的急慢性炎症。为进一步确证奇任醇治疗RA的作用靶点，采用分子对接软件AutoDock比较奇任醇对RA相关靶点TNF-α，IL-1和IL-6的结合能力［51］。分子对接结果显示，奇任醇与IL-6结合能与相互作用优于TNF-α和IL-1，这为奇任醇治疗RA的免疫机制提供了一个新的解释。

林兵［52］从豆豉姜的二氯甲烷部分提取分离得到化合物9，9′-O-二-（E）-阿魏酰基-内消旋-5，5′-二甲氧基开环异落叶松树脂酚（LC36）。LC36对LPS诱导的RAW264.7细胞产生的TNF-α和NO有明显的抑制活性，IC50分别为10.4 和22.9 mg·L-1；LC36 0.1 μmol·L-1对破骨细胞的中酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）酶有显著抑制作用，表明该化合物具有良好的抗炎潜力。将LC36与RA靶蛋白（P38 MAPK，JAK1，JAK3，MEK1，组织蛋白酶 K，Syk和c-JNK）进行分子对接来预测靶点。MVD软件分析化合物与7个靶蛋白结合能力，发现该化合物与P38 MAPK、MEK1和组织蛋白酶K的对接能量值低于原配体，并且通过氢键和疏水作用与这3个蛋白结合，较好地嵌于蛋白的活性腔中。细胞热转变分析（cellular thermal shift assay，CETSA）证明了该化合物在细胞内可与MEK1和组织蛋白酶K蛋白结合，说明分子对接技术在靶点预测方面有一定的可行性，同时也表明该化合物是通过多个靶点发挥治疗RA作用。

化合物D182是一种海洋来源的共生菌产物，对LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF-α和IL-6有明显的抑制作用，其作用靶点可能位于骨髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）中。MyD88是TLR2，TLR4和TLR6三条信号通路共同具有的髓样分化因子初次应答基因。通过模拟分子对接（DS 3.0）选择TLR2，TLR4和TLR6信号通路中共有的蛋白MyD88、IL-1受体相关激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase4，IRAK4）和IRAK1进行研究。分子对接模拟这几种蛋白与D182的结合作用，发现D182与IRAK4存在较好的结合能力，对接结果预测D182和IRAK4活性中心的氨基酸通过氢键和离子键结合。由于在TLR信号通路中，IRAK4通过其磷酸化而影响下游通路，细胞实验中发现D182处理细胞后，可以抑制LPS引起的细胞中IRAK4的磷酸化和IRAK4的降解，这也证实了D182对TLR共有的下游通路MyD88有一定的抑制作用［53］。

含有异噁唑杂环的甘草次酰胺类衍生物TY501能抑制RAW264.7细胞的增殖，且作用强于阳性对照药泼尼松龙［54］。刘巍等［55］应用反向分子对接预测TY501抗炎的可能作用靶点。将TY501与PDB数据库中检索到的P38 MARK等5种炎症相关受体的蛋白质晶体结构进行分子对接（MOE软件），分析结果图与对接分值，发现MMP的活性中心的金属离子是部分酸性非甾体抗炎药中结合基团所必需的位点，并推测出TY501的抗炎作用机制可能与MMP相关。

蟾毒灵（bufalin）是中药蟾酥的活性成分，具有显著的抗肿瘤和抗炎活性，为深入阐明作用机制，采用反向分子对接预测潜在的作用靶蛋白［56］。使用AutoDock软件，虚拟筛选蟾毒灵的13个潜在靶蛋白，发现抗炎靶点可能是二磷酸腺苷核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP〕、iNOS和FK506结合蛋白，其中PARP的可信度最高。PARP家族是由PARP-1和其他的酶组成，其中PARP-1可导致ATP耗竭细胞死亡，氧化应激和炎症转录因子的启动，其功能与蟾酥的药理效应有着良好的相关性。蟾毒灵0.3和0.6 mg·kg-1可显著抑制角叉菜胶致炎的大鼠足跖肿胀和炎症组织中iNOS，COX-2，TNF-α和胞核内 NF-κB p65 的蛋白水平［57］。分子对接应用于预测蟾毒灵抗炎的结合蛋白，对研究蟾毒灵的作用机制具有一定的意义。

独脚金内酯类化合物GR24通过对NF-κB信号通路的阻断作用表现出显著的抗炎活性。为进一步阐明作用机制，利用分子反向对接技术确定GR24在NF-κB信号通路中的潜在作用靶点［58］。通过分析从PDB检索到的62个靶蛋白结构，与GR24分子对接分值最高的3种靶蛋白分别为PARP1，酪蛋白激酶2和蛋白激酶B。通过表面结合模式，二维平面图分析及与PARP1抑制剂对比，表明GR24具有作为PARP1抑制剂的可能性，为研究独脚金内酯的抗炎作用及机制提供参了考依据。

中药成分黄连碱具有显著的抗炎活性，为深入研究该化合物对炎症通路的调节机制，利用反向分子对接技术，对炎症通路相关蛋白进行虚拟筛选，以确定黄连碱的高亲和性靶蛋白［59］。选取TLR4/NF-κB、P38MAKP和Janus激酶-信号转导转录激活因子3炎症通路上30个蛋白的晶体结构，利用AutoDock Tools对所有蛋白质结构和小分子配体进行加氢、加电荷等处理，AutoGrid计算靶标蛋白的活性位点，AutoDock对黄连碱在活性区域位点进行构象搜索，根据对接自由能的高低，筛选出亲和力高的靶蛋白。最终得到4个与黄连碱具有高亲和性的靶蛋白（P13Kδ，P13Kγ，IKKβ和 P13Kα）。PYMOL1.5.0.4与LigPlot+软件分析分子对接结果，发现黄连碱与结合位点形成氢键和疏水作用，从而紧密结合在活性位点上，推测黄连碱通过抑制上述4个靶蛋白阻碍炎症信号传递，影响下游蛋白的表达，进而发挥抗炎作用。

4 结语

传统的中医理论结合现代化的科技手段有助于进一步阐释中药的物质基础和作用机制。利用计算机模拟方法探讨中药的作用机制，不仅可以弥补药理学实验方法的缺陷，减少研究的盲目性［2，23，60］，更重要的是在中药新药研究领域，建立全新的理念和先进的研究手段，提高新药研究成功率为中药的发展提供新途径。众多的虚拟筛选结果得到了体内外药理实验的支持，说明分子对接技术在虚拟筛选中药活性方面具有一定的可行性。当然，也存在分子对接结果与实际药理实验不一致的情况［11，15］。同时分子对接（虚拟筛选）与药理实验还存在一定的脱节现象，分子对接中选用的中药活性成分，可能不易制备或含量较低，缺乏相关的药理实验数据；而药理实验中选择的中药成分往往是含量较高、易于制备的，但其活性不一定显著。目前一些利用分子对接技术发现中药活性成分的研究仅限于虚拟筛选阶段，并未提供实际的药理实验验证，缺乏完整性。后续的相关研究中，应注重分子对接与实验验证的连贯性和完成性，逐步修正软件参数的设置，提高预测的准确性。

中药在抗炎免疫方面具有良好的临床应用记录，尽管具备了液质联用等现代色谱技术手段，但完全地确定其药效物质仍面临诸多困难，多种物质的协同作用也增加了活性机制的复杂性。以分子对接为主要手段的网络药理学在确定抗炎中药的物质基础和阐明作用机制方面有着特殊的优势。计算理论方法与软件的不断完善将使分子对接技术在中药抗炎方面发挥更大的作用。