采用组合方法制备具有抗微生物活性和透气性的PVA纳米纤维

制备了采用蜂蜜和聚六亚甲基双胍（PHBM）混合物（Reputex20）处理的电纺聚乙烯醇（PVA）纳米纤维，并评价其在伤口敷料中的适用性。使用傅里叶变换红外光谱来证实从蜂蜜和Reputex20的功能部分引入电纺PVA纳米纤维。通过评估其抗微生物活性、透气性和抗张性能来表征官能化PVA纳米纤维。用蜂蜜和PHMB混合物处理的PVA纳米纤维显示出良好的抗微生物活性和足够的透气性，这是应用于伤口敷料的纺织材料的非常需要的特性。由诸如PVA的生物相溶性聚合物制成并以组合方式功能化的纳米纤维可用于许多不同的生物医学应用，包括伤口愈合绷带和细胞或组织培养支架。纸浆和造纸工业可以采用类似的组合处理方法并根据需要为各种应用开发多功能纺织品。

静电纺丝能够生产具有纳米级直径的纳米纤维的分层结构，得到了科学界的广泛关注。电纺丝纳米纤维提供的另一个优点是可以将其功能化，以赋予纺织品、生物医学和生命科学过滤、防御等附加属性和用途。伤口敷料是电纺丝纳米纤维在生物医学领域的重要应用之一。

一种理想的创伤敷料必须模仿细胞外基质（ECM）的结构和功能生物学。这促进了上皮细胞的形成和新组织的形成。在体内，ECM通过向细胞提供物理支持并促进细胞附着、增殖、迁移和分化的条件，在伤口愈合过程中起关键作用。随着纤维的小直径和随机取向，电纺丝纳米纤维使得ECM的结构复杂性降低。纳米纤维的高表面积有助于在伤口附近纳入合适的药物和液体的吸收，更重要的是，纳米纤维的高孔隙率使得细胞与外部环境之间的流体和气体交换成为可能，防止伤口干燥和脱水。此外，纳米纤维中的小孔尺寸防止外源微生物的渗透。

开发用作潜在伤口敷料的电纺丝纳米纤维可分为4类：（1）无源；（2）交互式；（3）高级；（4）生物活性。被动伤口敷料符合伤口敷料的物理性（水和气体渗透性）和形态（孔隙度）要求。需要这些性质以保持伤口周围的足够水分并保护伤口组织免受机械创伤。交互式伤口敷料具有增值能力，例如限制伤口部位的细菌增殖并照顾形态学和物理要求。先进的交互式伤口敷料是药物涂层的交互式伤口敷料。生物活性伤口敷料是具有足够机械性和物理化学性质的多功能系统

以前我们实验室的研究表明，用蜂蜜处理PVA纳米粒子（在本研究中使用）增强了它们的水汽传输特性。然而，蜂蜜对处理的PVA纳米粒子没有赋予任何抗微生物活性。另一方面，PHMBs被证明是广谱抗微生物剂，其具有低风险和优异的收缩期特性，使用PHMB的另一个优点是微生物发展抗性的可能性，对于PHMB而言可以忽略不计。以前的研究表明，使用基于PHMB的微生物溶液（Reputex20）处理PVA纳米纤维已经赋予PVA纳米纤维的抗微生物活性，但损害了它们的水汽传输特性。

本研究采用了一种组合方法，其涉及用蜂蜜和Reputex20混合物处理PVA纳米粒子。研究该方法在一系列应用中是否可以赋予电纺丝纳米纤维的多种功能。本研究的目的是通过蜂蜜和PHMBs的混合物应用于伤口治疗，使其具有可吸入的可呼吸性，并将其与PVA纳米生物的有益特性结合在一起。

1 实验方法

1.1 材料

PVA（重均相对分子质量为89 000～98 000，99%水解）和Mueller Hinton琼脂；液体培养基、大肠杆菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 29213，市售；Reputex20杀菌剂溶液来自美国某公司；100%纯度，未过滤的蜂蜜，来自美国某公司。

1.2 静电纺丝溶液的制备

在90∶10离子水中有12%的PVA溶液和用作静电纺丝原液的Rputex20蜂蜜混合物以前述方式制备。PVA的浓度是由初步实验决定。首先将2.4 mg PVA溶解在15 mL去离子水中，在温度80℃下间歇搅拌3 h。制备2 mL Reputex20、2 mL蜂蜜和1 mL去离子水的混合物，最终在使PVA溶液达到室温后，使用磁力搅拌器将2种溶液混合，将PVA溶液升至室温以使Reputex20和蜂蜜的高温效应最小化（这可能会损害混合物的性能）。

1.3 电纺设置

将装有20号针头并装有该涂料的注射器放在PHD2000注入/抽出泵上。我们保持了0.02 mL/min的聚合物质量。使用ES 30P.5W电源单元（γ高压研究）将注射器的针头充满25 kV的电压来纺丝纳米纤维。将铝收集器放置在与注射器的尖端。

Reputex20和蜂蜜中的PVA溶液制备的纳米纤维作为经处理的PVA纳米纤维。处理的PVA纳米纤维在155℃的温度下热交联30 min以提高其在水性条件下的稳定性，并且被称为处理/热交联的PVA纳米纤维。

1.4 扫描电子显微镜对PVA纳米纤维的描述

使用Hitachi S-4300SE/N扫描电子显微镜（SEM）来表征处理过的PVA纳米纤维的形态。使用2 kV的加速电压，在纳米线上无涂层。通过从网的各个位置测量80根纤维的直径来计算纤维平均直径。

1.5 傅里叶变换红外光谱测量

使用Bruker Vertex70分光光度计获得所有样品的衰减全内反射模式傅里叶变换红外（FTIR）光谱。分光光度计配备液氮冷汞-碲化镉检测器，光谱记录在4 000～800 cm-1的范围内。以4 cm-1的分辨率测量的平均128个干涉图，并用Blackman-Harris 3项函数进行蜕化以计算光谱。来自帕克Balston模型75-52吹扫气体发生器的干燥空气用于连续吹扫分光光度计台和样品室。所有的测量都是在温度23℃下进行的

布菌侵犯血液系统时表现为白细胞减少、血小板降低和贫血。血小板减少症是布菌感染血液系统最常见的并发症。血小板减少症的原因尚不清楚，可能与脾功能亢进、血管炎、骨髓抑制、自身免疫性溶血和血小板破坏有关。Demir等[44]对48例布病血液异常患者骨髓活检结果分析，吞噬细胞的吞噬作用、骨髓中肉芽肿形成和脾功能亢进可能是导致布菌血液病的主要原因。

1.6 抗微生物活性试验

针对革兰阳性（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性（E.coli）细菌测试了处理和处理/热交联的PVA纳米纤维的抗微生物活性。简单来说，将一个测试细菌的细菌条纹划到新鲜的Mueller Hinton琼脂平板上。将板培养24 h以具有用于评估处理的PVA纳米纤维的抗微生物活性的活性接种物。一种0.5麦克法兰德（McFarland）当量的浊度标准测试菌被纹在新鲜的琼脂板上并与纳米纤维（切成6 mm直径的圆盘）培养24 h。抑制剂的存在表明抗菌素活性。纳米纤维在紫外线（每侧15 min）下灭菌，以避免任何放射性污染问题。经处理的PVA纳米粒子命名为HR（HR1，HR2和HR3），将处理/热交联的PVA纳米粒子命名为CL（CL1，CL2和CL3）。

1.7 处理过的PVA纳米纤维的湿蒸气传输率评估

英国标准蒸发皿法BS 7209：1990《水气渗透服装织物规范》用于评价经处理的PVA纳米纤维的水蒸气渗透性，根据蒸气传输速率（MVTR）[g/（m2·d-1）]测量来表征纳米纤维的透气性，并使用方程式（1）来计算：式中：M为在一个给定时期t（g）的集合中的衰减量；t为在连续的质量之间的时间（h）；A为暴露试验样品的面积（0.005 413 m2）。

1.8 对PVA纳米纤维的抗张性能的测定

用英斯特朗电子拉力机5569拉伸试验机测量处理的PVA纳米纤维的抗张性能。使用2.5 mm/min的十字头速度的2.5牛顿载体细胞进行测量。确定最大负载（N），最大负载延伸（mm）和最大模量（MPa）的最大值。使用2 cm的标距。将样品切成尺寸为1 cm×3 cm的片状，进行试验。采用ASTM D638-10《塑料拉伸性能的标准试验方法》（修订版）进行测量。

2 结果与讨论

2.1 处理过的PVA纳米纤维的形态

图1显示了经处理的纳米纤维的SEM图像。

经处理的PVA纳米纤维的平均纤维直径为548 nm（±162 nm）。大多数纳米纤维的直径为400～700 nm。纳米纤维的形态似乎受到蜂蜜存在的影响，导致形成珠状结构。这可能是由于蜂蜜引起的静电纺胶粘剂黏度的增加。蜂蜜是一种高黏度的溶液，它确实增加了静电纺丝原液的黏度，在处理/热交联的PVA纳米纤维上不能进行进一步的研究。

图1 经处理的PVA纳米纤维的扫描电子显微镜图像和纤维直径分布直方图

2.2 处理的PVA纳米纤维的FTIR光谱

图2和图3显示了比较天然的（native）和处理的PVA纳米纤维的红外光谱测量结果。

经处理的PVA纳米纤维的光谱（图2和图3）包含蜂蜜和Reputex20溶液和天然PVA纳米纤维共有的特征。在天然PVA纳米纤维中不存在1 012 cm-1和2 210 cm-1处出现的峰。在1 025 cm-1附近的峰值明显。

蜂蜜和出现在2 l76 cm-1的峰值在RePutex20光谱中也很常见，光谱中显示了在静电纺丝过程中成为合成PVA基质的蜂蜜和RePutex20溶液的组分（图2和图3）。与蜂蜜相关的特征是非常明显的。相比之下，Reputex20的特征更难以辨别，蜂蜜可能比RePutex20更有效地竞争PVA基质内的结合位点。

在较低能谱区域，天然PVA非网络具有与C—O振动相关的1 094 cm-1附近的强带，天然PVA纳米纤维（图2的“a”）光谱中的1 050～950 cm-1区域是相对无特征的。蜂蜜的光谱在1 025 cm-1附近具有强峰，其具有延伸到较高能量CO特征的较弱特征，蜂蜜共振的弯曲振动。在处理的PVA纳米纤维中鉴定了1 012 cm-1附近的峰，这可归因于蜂蜜在PVA基质内的掺入。

图2 在800～1 700 cm-1的低能量区域（紫外线）中的（a）（天然）PVA纳米纤维，（b）PVA纳米纤维，（c）纯蜂蜜中的样品的全内反射光谱，（d）纯Reputex 20解决方案

图3 在1 000～3 500 cm-1的高能区域，样品的全内反射光谱的衰减[（a）（天然）PVA纳米纤维，（b）PVA纳米纤维，（c）纯蜂蜜，（d）纯Reputex20解决方案，（b）扩展了横坐标为5的波数区域的Y轴刻度]

在较高的能谱区域中，在处理的PVA纳米纤维的四面体中出现了2 210 cm-1附近的弱带（图2的“b”）。在2 l76 cm-1的Reputex20光谱中可以看出类似的谱带，其可以被吸引到CN拉伸腈基。该带为Reputex 20中的功能部分整合到PVA基质中提供了附加价值。

没有从处理/热交联的PVA纳米纤维上获得光谱。处理后的PVA纳米线变得非常脆弱，用于在热交联后用衰减的全反射晶体进行检查。

2.3 处理过的PVA纳米纤维的抗微生物活性

抗微生物活性是伤口敷料重要的属性。前人尝试用蜜蜂对PVA纳米纤维进行功能化。

蜂蜜功能化的PVA纳米纤维对测试的微生物没有抑制作用，尽管纯蜂蜜表现出显著的抗微生物活性，其原因可能是蜂蜜的浓度低，活性成分从纳米纤维有效扩散了。蜂蜜是一种非常黏稠的溶液，当用于静电喷涂时需要稀释。因此，在本研究中添加了一种市售的抗微生物Reputex20，其中含有PHBM与PVA溶液和蜂蜜的混合物。这是为了考察其组合方法是否有益处。

图4显示了用经处理的PVA纳米纤维对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗微生物的测定结果。

图4 处理/热交联（黑色）PVA天竺葵的抗微生物活性[（a）纳米纤维对大肠杆菌的活性；（b）金黄色葡萄球菌纳米纤维的活性]

经处理的PVA纳米纤维[图4（a）和图4（b）]已经证实了对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗微生物活性。在处理过的PVA纳米粒子[图4（a）和4（b）中的HR1、HR2和HR3]附近观察到抑制区，表明处理与PHMBs和蜂蜜的混合物具有功能化的PVA纳米纤维。

处理的纳米纤维的FTIR光谱的结果也支持这一观察，其中观察到从Reputex20引入活性部分（PHMB）到PVA基质中。S.aure的抑制区的直径为13 mm。

2.4 官能化PVA纳米棒的透气性

伤口敷料经常被忽视的属性是透气性，它控制着伤口中水分和其他渗出物的损失。研究表明，伤口敷料在2 000～2 500 g/（m2·d-1）范围内的呼吸能力可防止伤口过度脱水和伤口渗出物积聚。这就是为什么我们要求以实验来定量官能化PVA纳米纤维的透气性。

在我们的研究中，官能化PVA纳米纤维的透气性是为185 685 g/（m2·d-1）（n=5，se=3 632）。因此，可以推断官能化PVA纳米纤维已经显示适合用于伤口敷料应用的透气性值[在2 000～2 500 g/（m2·d-1）的范围内]。这样的现象可以解释为以下几点原因。首先，FTIR光谱已经证实蜂蜜成分与功能化PVA纳米纤维的结合。这涉及将碳水化合物功能组1纳入PVA基质。这解释了官能化PVA纳米纤维显示出优异的湿气传播特性，因为基材的透气性受到表面官能团的存在的很大影响。在我们的研究中，FTIR光谱表明向PVA基质中添加碳水化合物官能团。天然PVA纳米纤维谱（图2的“a”）谱带中的3 329 cm-1波段来自聚合物中醇基的O—H伸缩振动。在功能化PVA纳米纤维的光谱中，带宽显着转移到能量（3 240 cm-1）（图2的“b”）。这种转变反映了O—H基团氢键的作用。

2.5 官能化PVA纳米纤维的抗张性能

伤口敷料必须具有一定的机械性能，例如抗张强度、可持续性、柔韧性、弯曲性和弹性。在这些物理处理中，抗张性能至关重要，因此我们强调评估官能化PVA纳米纤维的韧性。

表1显示了韧性的测量结果。

表1 官能化PVA纳米纤维的抗张性能（n=5）

FTIR分析结果表明，官能化PVA纤维素谱图中1 145 cm-1处有一个尖峰（图2的“b”）。该峰的强度和锐度是增加PVA结晶度的特征，这在蜂蜜和Reputex20中也是明显的。在PVA聚合物中的Reputex20和O—H基团中胺基和亚胺基之间的氢键驱动的PVA基体中的组织增加可能导致官能化PVA纳米纤维中的1 145 cm-1峰的增长，或由于碳水化合物和PVA聚合物链段之间的相互作用而导致的PVA基质中排序的结果。因此，与天然PVA纳米纤维相比，功能化过程可能导致官能化PVA纳米纤维的抗张性能增加。

3 结论

采用组合方法制备生物活性和透气电纺PVA纳米纤维，通过用蜂蜜和Reputex20的混合物官能化的PVA纳米微粒。FTIR分析证实了在官能化的PVA纳米纤维中存在来自蜂蜜和Reputex20的功能部分。官能化的PVA纳米纤维显示出良好的水汽传输特性，并表现出优异的抗微生物活性。官能化过程也导致PVA纳米纤维的抗张性能的提高。本研究强调了使用天然和后加工物质组合的电纺丝纳米粒子功能化的重要性，以提高其适用性。