新生儿缺氧缺血性脑损伤动物模型的研究进展

吴国娇，王佩佩，赵玲玲

中南大学湘雅三医院，湖南长沙市410013

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是指围生期窒息而导致脑的缺氧缺血性损害。当窒息时，由于脑血流量分布不平衡及脑血流自动调节功能不完善，导致脑动脉供血区域血流减少。HIBD是新生儿死亡和致残的主要原因之一[1]。建立一种模拟其病理过程的动物模型对研究该病至关重要。本文从建模的方法和模型评价等方面进行综述。

1 动物的选择

2004年Yager[2]统计200多例HIBD动物模型的实验研究，其中模型动物中大鼠应用最广泛(29%)，其次是猪和羊。由于大鼠脑的血液供应与人类相似，且具有易获取、花费少等优势，常选择作为模型动物。但也有采用灵长类动物的[3]。造模时间一般选择出生后7 d至10 d，该时间段的大鼠脑组织类似于32～40周妊娠胎儿的大脑发育[4-5]。Bjelke等[6]采用孕鼠建立窒息模型。

模型动物通常雌雄均可。

2 建模方法

建模过程包括麻醉方式、药物和造模方法的选择。常用的麻醉方式有吸入麻醉和注射麻醉两种。Chen等[7]在关于延长异氟烷暴露时间能否改善HIBD大鼠脑梗死程度的研究中提出，常用吸入麻醉药物(地氟烷、氟烷、异氟烷等)和静脉注射麻醉药物(巴比妥类、丙泊酚等)均对HIBD有不同程度的神经保护作用。骆健明等[8]也发现麻醉组大鼠脑组织病变不明显，非麻醉组脑组织变性、坏死显著，说明麻醉药物对脑损伤有不同程度的保护作用。

主要的造模方法包括阻断动脉血管、夹闭气管和建立宫内缺氧环境等。其中阻断动脉血管的方法有单侧颈总动脉结扎(unilateral carotid artery occlusion,UCAO)、双侧颈总动脉结扎(bilateral carotid artery occlusion,BCAO)和大脑中动脉闭塞等。

1960年，Levine[9]采用结扎颈总动脉和缺氧在成熟大鼠建立脑缺氧缺血模型。1981年Rice等[4]在Levine的基础上将成熟大鼠改为新生大鼠，建立HIBD模型，被人称为Rice模型。其后很多学者对该模型进行改良，现已成为研究HIBD的经典模型[10-11]。有人提出手术时间应控制在10 min以内，以提高脑梗死的一致性[11-12]。术后休息1.5～2 h。若休息时间太短，大鼠存活率将降低；若延长，梗死变异性将增大[12-13]。较低(3%～4%)氧浓度主要用于诱导急性缺氧，而较高(7%～10%)氧浓度诱导慢性缺氧[14-15]。术后暴露于含有8%O2的缺氧箱中90 min或180 min，可分别诱导不同程度的脑损伤[16-17]。Rice模型操作简单，成功率高。由于Willis环的对侧代偿，单独的缺血并不能造成脑损伤，只有联合缺氧导致血管低氧张力才能诱导脑损伤[4,18]。

1991年，Schwartz等[19]改良Rice模型，将单侧颈总动脉结扎改为双侧结扎，休息4～6 h置于6.5%O2的缺氧箱内1 h建立BCAO联合缺氧诱导HIBD的模型，并发现，缺氧时间从15～60 min，死亡率从0上升到32%。Le Blanc等[20]在出生0～3 d新生猪上应用该方法造模，结扎双侧颈动脉30 min，在含6%O2的缺氧箱中15 min，复制了新生猪HIBD模型。该模型较稳定，可以造成较为一致的HIBD，但技术要求高，较难实施[21]。

Derugin等[22]采用尼龙丝闭塞出生后7 d大鼠的大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)，3 h后取出尼龙丝建立短暂性大脑中动脉闭塞模型。也有研究发现，单独MCA闭塞和短暂UCAO(1 h)未发现明显的缺血损伤；而电凝MCA联合短暂性UCAO(1 h)可观察到明显的脑梗死和神经细胞凋亡、坏死[23]。因此推荐电凝MCA联合同侧UCAO 1 h建立永久性大脑中动脉闭塞模型。但这两种方法的整个过程只是脑缺血，并没有降低吸入氧浓度，与围产期HIBD的再灌注过程相似。该模型能产生明确的梗死，但技术难度大，目前较少使用。

2017年，徐颖等[24]麻醉出生后7 d大鼠后，分离气管，用血管夹夹闭气管造成缺氧，称气管夹闭法。缺氧时间从8 min延长至14 min时，大鼠存活率从83.3%降低到26.7%。在损伤早期，缺氧大鼠均出现相似的临床脑损伤病理改变，包括坏死、出血和核固缩等。该造模方法操作简便，能准确地控制缺氧时间，与HIBD临床病理生理过程相似，值得推广。

有很多学者选取妊娠动物建模。Bjelke等[6]将即将生产的孕鼠子宫外置于含生理盐水的37℃水浴箱中，建立HIBD窒息模型。窒息时间超过15 min后，死亡率快速上升[25]。该模型减少了手术和麻醉的影响。薄涛等[26]通过结扎孕鼠双侧子宫动脉建模，但方法复杂，技术要求高，现很少使用该方法造模。后来，Tan等和王能里等[27-28]在妊娠后期孕兔经股动脉插入Fogarty取栓导管，向球囊内注入生理盐水以阻断子宫动脉血供，建立HIBD模型。该方法与传统结扎子宫动脉法比较，操作简便，术后恢复快等。

3 评价建模的方法

3.1 组织病理学

术后1～3 d肉眼观察脑组织外观，发现损伤侧脑组织明显水肿、软化；术后7 d水肿减轻，脑萎缩及空洞形成[29]。术后72 h内分别称量大鼠脑半球湿重及干重，并计算水含量百分比，结果表明模型组含水量显著高于对照组[30]，说明HI损伤后可引起脑组织水肿。

评估脑梗死的染色方法主要是指2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色，一般在术后24～72 h进行，观察到HIBD组梗死体积与对照组比较明显增大[10]。亦可采用TUNEL染色、组织化学染色等方法进一步确定分子水平的脑损伤[10,31]。TUNEL染色是通过定位DNA片段检测细胞凋亡，HIBD组大鼠凋亡细胞数明显增多[32]。用苏木素-伊红染色，与对照组比较，HIBD组细胞肿胀，排列紊乱，出现广泛神经元丢失和坏死，明显的神经胶质细胞异常增生[30,33]。李玉宇等[34]的研究发现，在尼氏染色中，HIBD组相比于对照组可观察到，海马区部分神经元肿胀，排列紊乱，形态不规则。

3.2 影像学

对脑缺氧缺血性损伤敏感的影像学手段主要包括正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)、磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)等技术。Kannan 等[35]分别给正常和脑损伤新生幼兔静脉注射11C-(R)-PK11195(活化小胶质细胞示踪剂)，行PET扫描发现，脑损伤幼兔脑内11C-(R)-PK11195浓度与时间呈正相关，而正常组相反，说明脑损伤后有小胶质细胞的活化。但PET扫描具有放射性。MRI技术可定位脑损伤部位和范围，在评估脑损伤程度及预测远期行为方面具有重要价值[11]。Vial等[36]通过T2加权MRI手段发现脑损伤面积变化具有时间依赖性，术后3 d显著增加7 d达到高峰，随后逐渐减少，减少的损伤面积可反应水肿逐渐溶解消散。MRI技术具有客观、安全、敏感性高等优点，是影像学中常用的技术。

3.3 神经反射

术后1 h和24 h，采用翻正反射、悬崖调转反射和向地性反射等方法评估幼鼠的感觉运动功能。Ten等[37]发现感觉运动功能的评分高低与急性期脑损伤程度呈正相关，HIBD大鼠随缺氧时间的延长，功能评分越高，表明感觉运动功能损伤越严重。其对远期神经功能具有很强的预测价值。亦可在术前和术后8 h、16 h或24 h按Longa 5分法评估脑损伤程度，HIBD组Longa分数显著高于对照组，且评分越高，神经功能损伤越严重[30,32]。但Ikeda等[38]的研究发现，HIBD大鼠尽管存在学习障碍，但感觉运动功能几乎不受影响。

3.4 行为学实验

采用行为学方法对模型进行远期评估。常用行为学方法包括Morris水迷宫实验、旷场实验和平衡木实验等。

Morris水迷宫实验是一种评价动物神经运动能力和空间学习能力的客观方法，通过测定逃避潜伏期和平台跨越次数评估大鼠的空间学习记忆能力，可在出生后28～90 d的时间段开始该实验[31,33,39]。HIBD后大鼠运动表现和学习能力与脑梗死体积和脑萎缩程度相关。Arteni等和Ikeda等[31,38]发现，Rice模型的不同侧脑半球损伤动物水迷宫实验结果不同，但相比于对照组，HIBD组平均潜伏期明显较长，且穿越平台次数较少，但游泳速度无明显差异。提示有明显的空间学习记忆功能减弱，而运动功能无明显影响。在旷场试验中，通过记录动物在中央格的停留时间来反映其认知能力。停留时间延长反映认知能力差[40]。Peterson等[13]和Iqbal等[40]发现，HIBD组和对照组动物的旷场运动结果无明显差异。但陈飞[41]通过夹闭孕鼠子宫动脉诱导HIBD模型的研究中发现，HIBD组出生后21 d大鼠与对照组比较，中央格停留时间最长，两组有差异。而在出生后14 d、28 d、35 d、49 d时，两组无明显差异。利用平衡木实验评估动物的平衡和运动协调能力[7,13]。Peterson等[13]发现，HIBD组和对照组的表现无明显差异。而陈刚等[42]和庒蕾等[43]实验显示，HIBD动物在通过横杆时，神态踌躇不定。只有当转速＞50 r/min时，HIBD组与对照组和惰性气体处理组比较，协调能力变差和在平衡木的滞留时间缩短。提示HIBD对高难度平衡运动能力影响明显，而对低难度运动能力损伤较小。

行为学评估的结果很容易受实验者或观察者主观的影响，所以对HIBD模型的评定，应该以主观观察与客观手段相结合。因此，神经行为学的检测虽然很重要，但仍需结合组织病理学和影像学等手段。

4 总结

各种HIBD模型均有利弊，应根据实验目的选择合适的模型。目前，应用最广泛的是Rice模型及其改良模型，但该方法造成的脑损伤变异程度大，梗死不明显，将缺血缺氧分成两部分，并不能完全的复制HIBD的发病过程，因此仍需改进以提高脑损伤程度一致性，减少个体之间的变异。对于HIBD的研究，国内外研究现仍未有判断建模成功的标准方法，接下来需要探索哪种方法能更好地对HIBD模型进行评估。