植物抗逆和开花相关miRNA研究进展及在丝瓜上的应用

刘 哲， 许园园， 娄丽娜， 苏小俊

(江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 210014)

miRNA是一种非编码小RNA，总长度为20～22个核苷酸，存在于生物体内[1-2]。1993年第1个miRNA(lin-4miRNA)基因在线虫(Caenorhabditiselegans)中被发现，直到2002年第1个植物miRNA被发现[3-4]，对植物miRNA的研究才逐渐得到世界各国科研人员的关注。虽然对植物miRNA的研究从21世纪初才开始，与动物miRNA的研究相比还存在一定差距，但随着miRNA研究方法的不断更新以及专业仪器设备的更新换代，植物miRNA被发现的数量也不断增加，种类也不断丰富。目前，已经在拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(OrzasativaL.)、丝瓜属(Luffaspp.)、玉米(ZeamaysL.)、普通小麦(TriticumaestivumL.)、蕨类(Pteridophyta)等植物中陆续发现了不同数量和类型的miRNA[5-12]。

1 植物miRNA的合成

miRNA的生物进化过程在植物中是相对保守的，并且在植物和动物中有较大的同源性，使得其在结构和功能上有较大的相似性[13]。MIR基因编码植物miRNA，且在拟南芥中，大部分MIR基因位于基因间隔区[14]。miRNA的生物合成可分为以下几步：(1)MIR基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录形成miRNA初级转录物pri-miRNA[15]。pri-miRNA结构中含有1个特殊结构，即不完全的双链发夹结构，该结构能够被核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族蛋白DICER-LIKE 1(DCL1)特异性识别并加工为miRNA前体[13，16]。(2)在DCL1等蛋白的作用下，pre-miRNA颈环结构被去掉，进而形成具有miRNA/miRNA*复合体结构的双链miRNA[14]。(3)在解旋酶作用下，该双链miRNA在细胞质中被分解为2条单链，而miRNA在ARGONAUTE 1(AGO1)复合体的作用下得以保留，进一步形成能作用于靶基因miRNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，简称RISC)[17]。然后，miRNA被降解，但是有研究表明，有些miRNA并不会被降解[18]。

2 植物miRNA功能的研究进展

2.1 逆境相关植物miRNA的研究进展

作物产量的提高和品质的提升可受到逆境胁迫的影响，国内外科研人员正试图揭示这一复杂的植物生长发育机制，关于其生物学机制的研究也越来越得到重视。近年来众多研究表明，miRNA在植物胁迫响应和抗逆性提高等方面具有十分重要的作用[5，19]。研究发现，在逆境胁迫因子诱导下，植物体内会形成miRNA诱导沉默复合物，这些复合物能与靶mRNA通过互补配对结合，进而调节其相应靶基因mRNA的表达，从而有效调控下游与抵抗胁迫相关基因的表达，引起与相应抗逆性相关代谢产物的增多或减少，实现对逆境的适应。在调控靶基因时，1个miRNA可以调控多个靶基因，如在拟南芥中基因pho2和UBC24均可受miRNA399调控[20]；同时1个靶基因可受多个miRNA调控，如冯浩研究发现，兴资9104的条锈病抗/感性状是多条miRNA共同调控的结果[21]。

植物组织中的一些miRNA受几种不同非生物胁迫的诱导。miR169家族包含17个miRNA，它们具有9种不同的序列结构，干旱胁迫时，拟南芥通过抑制miR169a与miR169c的表达来提高抗旱性，但在水稻中，miR169g主要在根部和茎部表达，以提高水稻的抗旱性[22]。Kantar等利用 RT-PCR的方法研究发现，大麦叶片中Hvu-miR156a、Hvu-miR166、Hvu-miR171、Hvu-miR408的表达量在受到脱水处理后明显增加[23]；另外，利用miRNA芯片技术对小麦研究发现，经过不同时间的干旱处理后，根和叶中都有miRNA表达且表达量远高于对照[24]。在缺水处理时，蒺藜状苜蓿(Medicagotruncatula)芽和根中的miR398a/b和miR408表达量明显增加，而COX5b的表达受到抑制，说明编码铜蛋白的COX5b可响应缺水胁迫[25]。在低温诱导下，毛果杨miR168、miR477以及拟南芥miR169、miR171、miR172、miR408等表达量明显增加，但毛果杨miR156、miR475、miR476的基因表达量降低[26]。研究发现，在拟南芥中miR417的表达受盐害胁迫调节，其过量表达可提高拟南芥的抗盐性[27-28]。同一种miRNA在不同的生理环境下发挥的作用不同，如利用基因沉默技术研究发现，miR395通过靶定腺苷5′-磷酰硫酸(adenosine 5′-phosphoryl sulphuric acid，简称APS)和AST68参与调节硫酸盐在植物体内的积累和配置，而在高盐和干旱胁迫下的烟草(Nicotianatabacum)中，miR395的表达量明显提高[29]。

一些植物miRNA的表达可受重金属胁迫的影响。Ding等利用生物芯片对镉胁迫下水稻miRNA的表达进行分析发现，水稻中存在19个与镉应答相关的miRNA，其中miR528的表达量在镉胁迫下增加，miR162、miR168、miR396等的表达量下降[30]。在低硫的诱导下，拟南芥miR395的表达明显受到抑制[31]。植物中响应铜(Cu)胁迫的转录水平调控因子是miR398，在土壤高浓度Cu的胁迫下，miR398诱导超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)基因过量表达，合成更多的Cu/锌(Zn)-SOD酶，从而使铜离子流向SOD，降低铜离子的含量和毒害，使得植物体内的铜离子达到平衡。

2.2 miRNA参与植物开花调控的研究进展

miR156和miR172家族在调控植物开花过程中具有重要作用，同时，它们也是年龄途径的重要组成成员[32-33]。其中miR172在叶片和花蕾中的丰度随着植物年龄的增大不断增加，而miR156在胚胎和早期植物幼苗中的表达量较高，且随着植物年龄的增大而降低[34]。

在拟南芥中，与开花相关的miR156家族包括miR156a～miR156j共10个成员[32]，它们能靶向作用于17个SPL(squamosa promoter-binding potein-like)转录因子中的11个，并通过转录切割的方式下调这些SPL基因的表达。过表达miR156的植株表现出开花延迟和幼年阶段延长等现象[33]。同时，在其他作物如水稻、番茄、玉米中过表达miR156也表现为开花延迟，表明miR156在控制开花的作用上是相对保守的[35-37]。

miR172家族包括miR172a～miR172e共5个成员，它们主要在miR156下游抑制开花[38]。通过核染色质免疫共沉淀技术验证发现，miR156靶向基因为SPL9和SPL10，是miR172b的直接转录激活子，同时SPL9过表达转基因株系中miR172的表达水平明显升高[39]。在拟南芥中，miR172有6个靶基因，分别为AP2、TOE1、TOE2、TOE3、SMZ、SNZ[32]，这些基因是典型的开花抑制子，并且被miR172在转录水平抑制[40-41]。此外miR172的过表达也会导致FT、LFY、AP1等上调表达，同时，SMZ和TOE1也能调控FT基因表达[38]。

miR159靶向作用于MYB转录因子，而miR319靶向作用于TCP转录因子，它们在功能上有一定的冗余[42]。在拟南芥中，MYB33、MYB65、MYB101主要受miR159家族miR159a～miR159c 3个成员的调控[43]。有研究表明，miR159能参与调控植物开花中的赤霉素途径，能够促进拟南芥在短日照下开花[32]。TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、TCP24 等5个靶基因主要受miR319家族中miR319a～miR319c等3个成员的调控[44]。过表达miR319的拟南芥植株在长日照条件下呈现出晚花现象[45]，此外，失去TCP4基因功能的突变体植株也呈现出晚花现象[46]，进一步证明miR319在植物开花的控制过程中起到了重要作用。近年来，大量miRNA被发现与植物开花的时间调控有关，如miR390家族和miR399家族[42，47]。

3 丝瓜miRNA的研究

关于丝瓜及丝瓜所属的葫芦科miRNA的研究起步较晚。凌键利用重测序的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，简称SNP)数据分析了黄瓜miRNA位点的遗传多样性[48]。李超汉发现，NAM基因家族是miR164的靶标基因，可调控植物的生长发育，通过利用高通量测序与生物信息学手段研究发现，miRNA参与黄瓜嫁接苗对干旱、高盐、缺氮、缺磷胁迫的应答[49]。梁超琼等研究发现，植物抗病过程和生长过程中的MYB类转录因子主要受miR159和miR858调控[50]。郭清利对黄瓜叶片小RNA进行测序分析，在黄瓜叶片中共预测到82个miRNA，其中保守、非保守miRNA分别为42、40个，其中48个为首次发现的miRNA[51]。刘娜等通过Solexa测序分析发现，嫁接能够影响植物的生长发育，并能提高植物对胁迫的抗性[52]。Chen等利用下一代测序技术对丝瓜品种YLB05(耐褐变)和XTR05(易褐变)的基因表达谱进行分析，获得9.1 GB有效数据，提供了全面的转录组序列资源[9]。这些研究成果促进了丝瓜miRNA的研究，也为丝瓜耐褐变遗传育种的深入研究提供了新的思路，相信随着研究人员的不断努力和生物信息学等新技术的发展，丝瓜miRNA的研究会更为全面和深入。