Yap1在非小细胞肺癌发生发展及治疗中的作用

Yes相关蛋白1（yes-associated protein，Yap1）是Hippo通路的主要下游效应因子，可以调节组织稳态、器官体积、再生及肿瘤形成［1］。Hippo通路最初在果蝇中发现，在调节细胞增殖、凋亡及器官生长中发挥重要作用。在哺乳动物中，该通路高度保守。Hippo通路的某些组分可抑制细胞增殖、促进凋亡、调节干细胞/祖细胞扩增［2］，从而在调控器官体积中发挥重要作用。通路组分的变异或下调可致器官过度生长［3］。Hippo信号失活，可致Yap1去磷酸化，在核中聚集，继而上调转录因子，可调控与细胞增殖、再程序化、干细胞活性、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及抗凋亡等相关基因的表达［4］。另外，Yap1在肿瘤细胞对某些药物继发耐药中也发挥一定作用［5-9］。

Yap1过表达在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）、肝细胞肝癌、胃癌、结直肠癌、小细胞肺癌等多种肿瘤中是预后差的标志［10］。在临床前研究中，抑制Yap1可减少肿瘤进展、恢复化疗药物敏感性，Yap1有望成为新的治疗靶点［6］。最近，肿瘤免疫治疗方兴未艾，在NSCLC中的应用尤有前景。抗程序性细胞死亡因子1（programmed cell death 1，PD-1）药物niv⁃olumab、pembrolizumab及抗细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4）药物ipilimumab等免疫检测点阻滞剂在临床获得应用［11］，而很多其他药物正在研究中。Yap1可通过上调程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）或活化肿瘤细胞因子，募集肿瘤浸润性巨噬细胞、髓源性抑制细胞、调节性T细胞［12-14］，诱导免疫抑制性肿瘤微环境，从而促进肿瘤发展、降低药物敏感性、诱发肿瘤复发等。针对Yap1的靶向治疗可能抑制肿瘤发展，增强靶向治疗、免疫治疗等的疗效。

本文综述Yap1在NSCLC发生发展及治疗中作用的最新进展，并讨论了Yap1成为NSCLC治疗潜在靶点的重要性和必要性。

1 Yap1的NSCLC促癌作用

NSCLC中Yap1表达增高与组织学分级高、淋巴结转移、病理分期晚、预后差等密切相关［15］。通过对比NSCLC及正常肺组织中Yap1的表达，Yap1在66.3%NSCLC组织中存在表达，其中50%为高表达，且绝大多数在细胞核内，而核Yap1即Yap1的活性形式；而正常肺组织中Yap1的表达仅限于Ⅱ型肺泡上皮细胞。

1.1 Yap1促进NSCLC增殖、转移

Yu等［16］研究发现，NSCLC中Yap1较周围组织明显上调，通过细胞噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazoliumbromide，MTT）测试及Transwell检测发现Yap1过表达促进NSCLC A549及H460细胞系的增殖、迁移及侵袭。Yap1过表达可显著促进EMT相关标志物的特异表达。Yap1通过诱导Slug转录促进EMT，成为NSCLC转移的驱动因子。体外实验中，敲除Yap1可降低细胞迁移能力及转移瘤的种植，而活化的Yap1可促进小鼠肺癌进展［17］。

关于Yap1促进NSCLC增殖、转移的具体机制，研究发现其与Yap1的转录靶基因有关，如AXL、CYR61、AREG及EREG等［18］。另外，已知的几种癌基因多因编码区癌性突变而活化，但NSCLC中Yap1突变较少。有研究对1 312例患者开展全基因组测序，发现仅1.1%肺腺癌存在Yap1胚系R331W错义突变［19］，表明Yap1突变在促进NSCLC发生、发展过程中作用较小。

RASSF1A是Yap1的上游调节因子，可通过Hip⁃po通路抑制Yap1，减少NSCLC细胞的侵袭和转移［20］。另一个抑癌基因VGLL4也可通过抑制NSCLC中Yap1与TEAD的结合，负性调节Yap1/TEAD转录复合体［21］，从而起到抑癌作用。几种microRNA也可影响NSCLC中Yap1的表达。miR-138及miR-497直接抑制Yap1，减少肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及肿瘤生长［22］。Yap1的上游调控因子miR-424-3p可通过作用于Yap1降低NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力［9］。在神经内分泌肺癌中，活化的miR-375直接抑制 Yap1，防止肿瘤生长［23］。因此，Yap1 可促进NSCLC的增殖、侵袭及转移，其机制与Yap1的转录靶基因有关。一些抑癌基因和microRNA可调节Yap1表达，起到防止肿瘤生长的作用。

1.2 Yap1与NSCLC肿瘤干细胞

NSCLC肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）可通过自我更新和分化形成肿瘤，促进NSCLC发生、发展或治疗后复发。Yap1在NSCLC干细胞中表达升高，可直接作用于OCT4，上调SOX2，促进CSCs的自我更新及血管拟态，而去除Yap1可降低SOX2、OCT4及NANOG等胚胎性干细胞核心因子的表达，耗竭Yap1可减少多个EMT基因的表达，并防止鼠移植瘤的生长和转移，使Yap1缺失细胞中的SOX2过表达，可逆转这一过程［24］。

在FGFR1扩增型肺癌中，可检测到明显的CSCs活性，而Yap1可通过影响FGFR1信号转导以维持CSCs特性［25］。检测临床肺癌标本，发现Yap1的表达水平与FGFR1呈正相关。机制方面，Yap1通过TEAD结合位点在启动子水平上调FGFR1表达，而bFGF/FGFR1可通过大肿瘤抑制基因（large tumor suppressors 1，LATS1）诱导Yap1表达。Yap1缺失可去除肺癌细胞的自我更新能力。小鼠的正交模型显示了Yap1在肺癌形成及转移中的作用。verteporfin是一种Yap1抑制剂，可在肺癌中有效抑制Yap1及FGFR1的表达［25］。

2 Yap1与NSCLC治疗敏感性

2.1 Yap1与NSCLC化疗、放疗耐药性

化疗和放疗是中晚期NSCLC的主要治疗方法，对于无驱动基因患者，尤其是鳞状细胞癌患者，放化疗是主要治疗方法。但有部分患者易出现放疗耐受或化疗耐药等情况，导致治疗失败。对于耐受治疗的原因，目前有很多研究，结论并不统一。Cheng等［5］通过高通量RNAi筛查发现，Yap1与NSCLC细胞顺铂耐药及放疗耐受有关，去除Yap1可显著提高肿瘤对顺铂及放射线的敏感性。Yap1是miR-424-3p下游的靶基因，Zhang等［7］研究发现，miR-424-3p可抑制Yap1表达，miR-424-3p缺失可通过Yap1致使NSCLC化疗耐药。因此，Yap1会导致NSCLC治疗中顺铂等化疗药物耐药及放疗耐受。Yap1信号通路的抑制剂verteporfin，可通过增强顺铂/放射线相关的DNA双链断裂，与顺铂、放疗发挥对NSCLC细胞的协同作用［5］。因此，Yap1可致NSCLC化疗耐药及放疗耐受，其机制可能与减少DNA损伤等有关。

2.2 Yap1与分子靶向药物耐药性

如检测到NSCLC的驱动基因，则相应分子靶向药物可起到经典放化疗无法企及的疗效，且不良反应相对较小。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是最常见的NSCLC驱动基因。对于含有EGFR特定位点突变，即敏感型突变的NSCLC，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）可使肿瘤细胞凋亡，而对正常组织影响较小，故未能引起严重细胞毒性反应。但EGFR-TKIs也存在耐药问题，最常见的是出现EGFR20外显子的T790M突变及K-RAS突变等。Yap1为EGFR-TKIs耐药的原因之一。

体外研究发现，Yap1可促进人类NSCLC细胞对厄洛替尼耐药［6］。Yap1下调后，NSCLC细胞对厄洛替尼的敏感性提高［5］。Hong等［26］研究也发现，Yap1干扰EGFR-TKIs疗效，从而与NSCLC预后差相关。对于EGFR敏感型突变肺腺癌，如应用酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）之前细胞核高表达Yap1，患者的总生存期、无进展生存期较短，如同时伴有获得性EGFRT790M突变，预后更差。另外，TKI治疗后，Yap1核内表达明显增加。这表明Yap1在原发性及获得性EGFR-TKIs的耐药中均可能发挥重要作用。

关于Yap1致使EGFR-TKI耐药的机制，目前尚无定论。有研究认为，EGFR信号通路本身即与Yap1有关。肺腺癌组织中Yap1水平与EGFR突变状态存在相关性，EGFR突变后引起的信号通路活化可提高Yap1表达水平及活性［27］。而绕过EGFR通路降低Yap1水平的小分子，在减小EGFR依赖性细胞的活性方面较为有效，这包括EGFR T790M突变细胞，而其是TKIs耐药的主要原因。提示突变的EGFR可能是Yap1所致原发TKIs耐药的原因。这也说明Yap1有望成为EGFR依赖性肺腺癌患者，尤其是EGFR T790M所致TKIs耐药患者的治疗靶点。

另外，K-RAS突变型NSCLC中，核Yap1多于K-RAS野生型NSCLC［5］。这表明Yap1所致EGFR-TKIs耐药可能与K-RAS/MEK/ERK信号通路有密切联系。Wu等［28］降低miR-630表达后，Yap1表达增多，进而可持续活化ERK信号，诱发EGFR敏感型突变肺腺癌细胞的TKIs耐药。同时，ERK活化可致促凋亡蛋白Bad表达减少，通过调节凋亡通路，诱发TKIs耐药。联合吉非替尼与Yap1抑制剂verteporfin或MEK/ERK抑制剂AZD6244可几乎完全抑制裸鼠移植瘤的生长。肿瘤miR-630低表达及Yap1高表达的肺腺癌患者，TKIs疗效及预后较差。提示Yap1可能通过K-RAS/MEK/ERK信号通路发挥EGFR-TKIs耐药作用。

有研究发现［29］，EGFR敏感型突变的肺癌细胞在STAT3及Src-Yap1信号通路活化后，可耐受TKIs治疗。对于PC-9及H1975的EGFR敏感型突变NSCLC细胞系，同时靶向治疗EGFR、STAT3及Src可起到协同作用。应用TKIs一线治疗EGFR敏感型突变NSCLC患者，STAT3或Yap1高表达可预测较短的无进展生存期。

综上所述，Yap1可促进NSCLC对EGFR-TKIs耐药，但其耐药机制尚未明确，目前研究发现其可能与EGFR信号通路、K-RAS/MEK/ERK信号通路、STAT3通路等有关。

2.3 Yap1和免疫治疗

免疫治疗已成为恶性黑色素瘤、NSCLC、膀胱癌和肾细胞癌等多种肿瘤的标准治疗之一，美国食品药品监督管理局（FDA）批准了抗PD-1、抗PD-L1及抗CTLA-4药物［30］。上述肿瘤免疫（immune-oncolog⁃ic，IO）药物区别于传统抗癌药物，主要作用于肿瘤微环境而非肿瘤细胞。其可通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果，发挥抗肿瘤作用。虽较传统化疗药物低毒，免疫治疗对多种肿瘤的有效率仅为15%～30%。目前，仍不确定患者IO药物敏感性的机制，仅有少数关于宽泛机制的研究。对IO药物效果机制的更深层理解可帮助形成更为有效的治疗策略，如多种IO药物的联合治疗或IO药物与传统化疗药/分子靶向药物的联合。

肿瘤微环境的免疫活性与肿瘤进展及耐药情况高度相关。多种分子可诱导免疫抑制性肿瘤微环境，调节上述分子可能促进免疫应答性肿瘤微环境形成，进而抑制肿瘤进展，增强IO药物效果。Yap1在肿瘤微环境中的作用逐渐显现。在非肿瘤组织中，Yap1通过阻滞干扰素β信号通路中的干扰素调节因子3，负性调节固有抗病毒免疫反应［31］。PD-1表达于T细胞等多种免疫细胞的细胞膜上，而PD-L1是PD-1的配体之一，表达于多种肿瘤细胞及免疫细胞上［32］。二者均可帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸的分子，与NSCLC预后不良相关，也是免疫治疗的主要靶点。有研究发现，NSCLC患者的Yap1与PD-L1表达呈正相关［14，33］。另外，也显示Yap1直接上调PD-L1的转录。因此，Yap1可能与免疫治疗的疗效相关，但目前尚无明确临床证据。另外，Yap1与PD-L1的影响为相互的。PD-L1沉默后，Yap1及HIF-1α的表达同步降低。PD-L1引起Yap1上调可能导致非EGFR突变性TKIs耐药。吉非替尼对肿瘤细胞的抑制浓度，由PD-L1介导的Yap1表达决定。有研究发现，肿瘤PD-L1或Yap1 mRNA高表达患者的TKIs疗效劣于基因低表达者［34］。

综上所述，Yap1可与PD-L1相互影响，但目前鲜见明确的体外实验或临床研究可证实上述影响是否可转化为对免疫治疗疗效的决定因素。因此，亟需进一步研究从而明确Yap1与免疫治疗的关系。

3 结语

随着研究不断进展，Yap1在NSCLC发生、发展及治疗中的作用及其与化疗、靶向治疗及免疫治疗敏感性的关系逐渐明确。Yap1促进NSCLC的增殖、侵袭及转移，促进NSCLC CSCs的自我更新及血管拟态，降低NSCLC对化疗、放疗、EGFR-TKIs的敏感性。同时，Yap1与肿瘤微环境及PD-L1的关系提示其在NSCLC免疫治疗中发挥一定作用。上述研究结果提示针对Yap1开展靶向治疗的重要性及必要性。目前，已有相关机制及临床前研究［22］，但鲜见临床研究报道。

在临床前研究中，verteporfin可抑制肿瘤细胞增殖，减少干细胞活性，恢复药物敏感性并延长小鼠寿命［35］。目前，亟需更多的机制、临床前及临床研究，联合Yap1抑制疗法与其他抗癌药物有望成为新的治疗策略。