乙型肝炎分子生物学检验方法的应用及质量控制

马 雯

（宁夏人民医院临床检验诊断中心，宁夏 银川 750004）

作为临床最为常见的传染性疾病，乙型肝炎患者中每年都有数以百万的死亡例数。慢性乙型肝炎是HBV感染后的一种严重结果。在全球范围内，我国乙型肝炎病毒感染率位居前列。据不完全统计，我国现如今已有1.3亿人群属于乙型肝炎病毒携带者，慢性肝炎患者的数量已经超过2300万。我国病毒性肝炎患者接受治疗时产生的直接费用可达到500亿元。因此，准确、高效检测乙型肝炎病毒对预防和治疗具有非常重要的意义。

1 常规乙型肝炎检验

通常情况下，丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶是临床检测乙型肝炎病毒感染的常见指标，同时也是肝功能与血清免疫标志物。常见性的乙型肝炎血清标志物主要包括了HBcAg与抗-HBc、HbeAg与抗-Hbe、HBsAg和抗-Hbs。ELISA是临床中应用比较多的检测方法。该种检测方法能够将HBV的应答系统与表达物检测到，并能够确定病毒感染后的免疫情况，同时还可了解乙型肝炎病毒在患者体内的复制状况。ELSA检验方法操作简单、方便、快捷[1-3]。但敏感度并不是非常高。最近几年，国内外开始报道乙型肝炎病毒基因突变，分析HBsAg突变基因表达产物，就能够将不同的突变体存在的抗原差异显示出来。因此，即便临床检验的时候，使用的是相同的血清，可最终获得的检测结果就可能出现差异，由此也就表明临床指标存在漏检的现象。

2 HBV分子生物学检测

HBV-DNA是生物分子学常用的检测指标。根据该指标可确定乙型肝炎病毒是否存在、阴干病毒的活性和传染性等情况。检测该指标利用常规的聚合酶链反应和荧光定量PCR方法。

2.1 常规聚合酶链反应法：该种检验方法的原理类似于DNA复制过程。该过程主要由变性、退火、延伸等步骤构成。模板温度达到93 ℃后，双链就会在环境的作用下断裂为单链，单链就会引导DNA与引物结合。模板温度下降55 ℃时，模板上的DNA就会与引物相互配对结合。在TapDNA聚合酶的指引下，DNA模板-引物复合物就会在相应的原料下合成新的复制链。在此期间，不断重复这种过程，就会获得数量较多的半保留复制链。如此往复循环，每循环过程需花费2～3 min，在数小时内就可将基因扩至庞大规模。此种检测方法的灵敏度可达到ng水平，检测结果能够直接反应出HBV病毒的复制情况，从而为临床诊断提供根据[4-7]。但这种检测方法不能对准确基因定量、扩增污染物的假阳性和操作复杂等问题，由此影响临床使用效率。

2.2 荧光定量方法：荧光定量是在PCR扩增期间将荧光素标记的特异性引物，在扩增中不断出现能量转移，减弱荧光强度。经过多个循环后，PCR反应的荧光强度和模板的量就是检测指标中HBV-DNA拷贝的数据，实现定量的效果。应用荧光定量方法，可检测HBV-DNA期间，还能够进行量化，以此就可更好的了解乙型肝炎患者体内HBV复制和传染性，并反映出复制水平、病变程度和治疗进展。具有较高的特异性，灵敏度也非常高[8-10]。实际应用此种检验方法，无需处理PCR的产物。且通过闭关操作，可避免污染引起的假阳性。在此期间，使用实时检测技术，所获取的Ct值和原始模板数量表现出线性关系，可准确定量。该种方法具有PCR高灵敏度的同时，还可使用荧光探针。利用光电传导系统就可将PCR扩增期间的荧光信号探测到，以此获得定量结果，还具有DNA杂交的高特异性和光谱的高精确性，能够弥补PCR缺陷。荧光定量PCR在实际应用中显示出独特的诊断价值。治疗前对病毒定量检测，由此就可指导抗病毒药物的使用，以免盲目用药；治疗后通过PCR能够直接准确测定患者体内的病毒情况，有利于判断临床效率；怀孕前测定PCR，有助于选择最佳的怀孕时机；乙型肝炎孕妇检测PCR，可及时诊断病情。

3 HBV生物学检测的质量控制

HBV生物学检测的质量控制对临床诊断具有重要意义。首先，特异性。检测HBV-DNA，通过对核酸序列特异性的检测，就能够将碱基的特异性区别开[11-16]。在此过程中，需应用荧光定量检测技术的荧光产生的温度、离子浓度以及探针，经过不断的优化处理后，就可有效减少非特异性扩增。在此过程中，要实现特特异性扩增，还应注意聚合酶的选择、温度以及离子浓度等各方面影响因素。因而，在此过程中还需建立优化的扩增系统，才有利于BBV分子生物学检测。其次，灵敏度。实际操作中，灵敏度的影响因素主要包括样品的竞争性抑制物和其他抑制因子。对于不同核算扩增，实验操作人员和实验室均会影响灵敏度。其中PCR就遇到此种情况。因此，需加强各类因素指标的规范性，如统一试剂、操作人员对曲线上阴/阳性截取的统一等。最后，重复性。随机扩增，样品量少，变化性因素越多。此时就应当控制模板的循环数目，建立假阳性耐受性指标。在实验操作中，改善扩增和测定方法的同时，样本制备同样非常重要，由此就能够避免定量测定的差异性。另外还有样本对检测结果的影响加强控制。同时，实验室质控和实验间质评同样可达到质量控制效果。实验室质控可以购自公司，也可以自行配制；实验间质评可通过参加国家卫计委临检中心每年两次的室间质评活动。

4 结 语

乙型肝炎病毒生物学检验中，荧光定量PCR是目前最为理想的检验方法，在确定检验优点与质量控制的基础上，才能够采取预防性措施，发挥技术优势，预防假阳性和假阴性的结果出现。