细针穿刺活检结合分子检测在甲状腺结节鉴别诊断中的研究进展*

魏玺 王晓庆 王猛 高明 综述 张晟 审校

甲状腺结节在人群中是常见的一种疾病。随着高频超声的广泛应用，甲状腺结节的检出率明显增加［1］，其中大部分为良性结节，但仍然有5%～15%的结节被诊断为恶性且需要进一步临床处理［2］。甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲状腺癌中最常见的病理类型，占甲状腺癌的85%左右［3］。目前，甲状腺结节的过度诊断不仅导致不必要的手术治疗及相关医疗费用的上涨，而且存在并发症的风险。另一方面，甲状腺结节的漏诊则导致延迟治疗，若疾病出现进展，则需要进一步的临床干预［4］。因此，甲状腺结节的筛查及明确诊断尤为重要，有利于临床医师进一步优化治疗方案。本文拟对超声介导下细针穿刺活检细胞病理学，以及联合基因检测用于甲状腺结节鉴别诊断的研究进展进行综述。

1 超声介导下甲状腺结节细针细胞学活检病理诊断研究进展

目前，超声引导下细针穿刺活检（ultrasound guid⁃ed fine needle aspiration biopsy，US-FNAB）是评估发现甲状腺结节最可靠、最有价值的诊断手段之一［4］，也是方便、安全、有效地鉴别甲状腺结节性质的微创方法，常用作术前诊断甲状腺乳头状癌的“金标准”。对于甲状腺细胞学结果的解读，在临床应用最广泛的是2007年美国国家癌症研究讨论并通过的Bethesda分类系统［5］，诊断结果分为六类（括号内为恶性风险预测值）：Ⅰ：不能诊断或标本不满意（1%～4%）；Ⅱ：良性（0～3%）；Ⅲ：意义不明确的非典型性病变或意义不明确的滤泡性病变（5%～15%）；Ⅳ：滤泡性肿瘤或怀疑滤泡性肿瘤和嗜酸性腺瘤（15%～30%）；V：可疑恶性（60%～75%）；Ⅵ：考虑恶性（97%～99%）。基于此分类系统，作为甲状腺原发灶疾病诊断的有效方式，超声引导FNA在甲状腺癌的术前及术后评估中起着重要的作用。

在细胞学诊断过程中，依然存在无法诊断或不确定及意义不明确的非典型病变或滤泡性病变。这些诊断不确定的甲状腺结节包含了Bethesda系统中Ⅲ～V类，其恶性的可能性分别是5%～10%、20%～30%和50%～75%［5］。对于这些不确定结节，Bethesda系统以及指南中推荐重复FNA检查，但这些重复FNA中仍然有高达50%最终是细胞不足或不确定的结果。这些诊断不确定的甲状腺结节结果给临床医生及患者带来的问题比较棘手。若通过外科手术获得组织病理学诊断，则会导致不同程度的并发症及高额的医疗费用。基于此原因，许多科学家研究这类不确定的甲状腺结节，并使用相关分子标记物来提高FNA诊断的敏感性及特异性。随着甲状腺癌研究在基因、蛋白、RNA等微观水平上不断深入，已发现多种分子标记物与肿瘤的发生、发展及预后相关，也为甲状腺癌超声引导FNA为代表的早期诊断手段，以及后期的预后判断和靶向治疗提供了全新的方向。

2 基因检测在甲状腺结节US-FNAB中应用的研究进展

随着分子遗传学的迅速发展，有研究表明［6-8］分子基因检测FNA标本能够明显提高甲状腺结节细胞学诊断的准确性，尤其是针对不确定结节诊断的细胞学结果，显著提升其诊断的敏感性和特异性，有利于临床的诊治管理。目前，有结果显示细针穿刺细胞学联合分子基因检测，对于分化型甲状腺癌的诊断尤为可靠。

已有很多研究［9］表明在FNA细胞学诊断的基础上，提取标本进行分子标记物检测，包括RET/PTC重排、RAS、BRAF基因突变等均可强烈预示恶性结节。虽然提出很多癌基因及免疫化学标志物作为甲状腺癌诊断和预后的指标，但是其临床价值并未得到广泛认可［10］。究其原因是FNA细胞学方法不确定的细胞学标本中含有少量的不典型细胞，而这些细胞中混有很多炎性细胞、良性滤泡细胞以及基质细胞，因此后期在FNA针吸标本中发掘有用信息至关重要。而术前若对于不确定甲状腺结节，检测BRAF、RAS以及RET/PTC重排相关的重组分析，则为确诊甲状腺结节性质及后期制定手术方案起到了关键作用［11-12］。

2.1 RET基因重组

RET原癌基因重组最常见于甲状腺乳头状癌中，RET基因突变可引起甲状腺滤泡细胞恶性转化。这种突变是一种重组导致结构活化和增加信号下游MAPK途径［13-14］。RET重组有多于12种类型，但其中80%是RET/PTC1和RET/PTC3。前者与分化良好的组织学分级有关，提示预后较好，后者与侵袭性的肿瘤类型相关。RET基因突变与MTC关系最密切，FTC及ATC中均较少发现，提示RET基因突变对MTC尤其对FMTC的筛查和诊断有特定意义。研究证实RET基因突变与多发性内分泌腺肿瘤综合征（MEN）Ⅱ型（Ⅱa和Ⅱb）关系密切，也说明了其与髓样癌的相关性。虽然最初认为出现在50%甲状腺乳头状癌中，后来发现整体患病率5%～35%，因此这种突变不适合作为肿瘤的一种独立的筛选工具［15］。

2.2 BRAF基因突变

V-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体（vraf murine sarcoma viral oncogene homolog B，BRAF）最早在1988年于尤文肉瘤中发现，Raf家族中关于BRAF基因的研究较多，BRAF在细胞增殖、分化和凋亡中起到关键作用，也是甲状腺癌中最常见的突变基因。BRAF突变总的患病率约45%（27.3%～87.1%），且亚洲国家显著高于西方国家［16］。BRAFV600E突变在甲状腺癌发生过程中，通过上调细胞分裂和增殖导致肿瘤发生，且BRAFV600E突变被证明与腺体外侵犯、淋巴结转移、远处转移，TNM分期及癌症复发相关，是明确的预后不良因素［17］。研究表明，BRAF基因突变对于甲状腺乳头状癌的诊断敏感性较低，特异性较高。此外，术前BRAF基因突变分析联合超声介导的FNA检查结果，可以提高对于不确定甲状腺结节良恶性诊断的准确性［18］。然而此方法仍存在不足，首先是低敏感性，研究显示在BRAFV600E阴性的甲状腺结节中，39.7%～70.8%结节病理为恶性，其次是BRAFV600E突变仅与甲状腺乳头状癌相关，与其他病理类型甲状腺癌不相关［19］。

2.3 RAS基因突变

RAS基因突变是甲状腺肿瘤中第二个最常见的基因改变，主要存在于滤泡样病变。RAS原癌基因编码的三种不同膜相关的三磷酸鸟苷蛋白：HRAS、KRAS和NRAS。据报道［20］，RAS不同亚型的突变与不同的临床病理结果相关。K-RAS 12/13突变与N-RAS 61或者H-RAS 61突变相比预测甲状腺恶性结节能力较低，而其中N-RAS基因突变是最常见的RAS突变，且与甲状腺乳头状癌滤泡亚型相关［20-22］，而H-RAS基因突变的恶性率最高［22］。这些突变广泛存在于甲状腺滤泡癌和甲状腺乳头状癌滤泡亚型（40%～50%），较少出现在甲状腺乳头状癌经典亚型（10%）中［23］。虽然RAS基因突变也在良性滤泡腺瘤中被发现，但目前尚不清楚RAS阳性的滤泡型腺瘤是否会有一定的可能发展成为恶性。研究表明［24］在结果为不确定的FNA样本中，RAS突变对于恶性诊断的敏感性为34.3%，特异性为93.5%。较低的敏感性是由于RAS突变主要是与甲状腺肿瘤的滤泡性生长有关，包括良性滤泡型腺瘤及甲状腺滤泡癌，甲状腺乳头状癌滤泡亚型等。因此RAS突变分析不适合作为一个独立预测因素来鉴别甲状腺结节的良恶性［25-26］。

3 miRNA分析在甲状腺结节超声介导FNA中的研究进展

miRNA是长度较短的单链非编码小RNA片段，长度由19～23个核苷酸组成。miRNA认为是基因表达在转录后水平重要的调节因子。其控制各种细胞的发展和维护的过程，包括增殖、分化的过程，运动与细胞凋亡［27］。miRNA的表达具有组织特异性，肿瘤中miRNA与正常非肿瘤组织中的相比，在表达水平上发生了明显改变（上调或下调），可作为肿瘤诊断，预后及预测潜力的标志物［28］。

甲状腺被认为是miRNA表达参与肿瘤形成过程的非常适合的研究模型，因为甲状腺滤泡细胞可形成不同生物学行为的肿瘤［29-32］，miRNA在甲状腺的正常和肿瘤组织中的表达不同。miRNA的显著变化不仅出现在不同组织来源的甲状腺肿瘤中（如甲状腺滤泡细胞与C细胞），甚至存在同时起源于甲状腺滤泡细胞［33］。多项研究表明应用miRNA标志物可区分良恶性甲状腺结节［34-36］，但仅局限在部分类型的恶性结节中，如甲状腺乳头状癌［37-39］。研究表明对于FNA的细胞学标本miRNA检测，如miR-146b、miR-221和miR-222术前诊断甲状腺乳头状癌是可行的，但对于滤泡性肿瘤的准确性较低［39］。此外，miR-146b、miR-221和miR-222表达与甲状腺恶性肿物包膜外浸润相关［40］。miR-9和miR-21也可预测甲状腺乳头状癌的复发［41］。miR-181a-2-3p和miR-99b-3p上调与miR-222下调也提示甲状腺癌滤泡亚型有较好预后［42］。许多研究表明，滤泡型腺瘤和滤泡癌的miR⁃NA表达谱有很多重叠［35，43］，究其原因是miRNA表达的变化主要发生在从正常甲状腺细胞转变为滤泡型腺瘤细胞的过程而不是从滤泡型腺瘤到滤泡癌的过程，因此对于滤泡性肿瘤的研究表现较低的准确性［43］。FNA细胞学标本的4个miRNA表达检测（如miR-26a、miR-146b、miR-221和miR-222）上调，可用来辨别甲状腺未分化癌和淋巴瘤［44-45］。很多血液循环中的miRNA可以作为甲状腺肿瘤预后的标志物，循环中的miRNA作为标志物的主要作用是监测甲状腺肿瘤的动态。

总之，随着分子生物学的进步，新型分子生物学技术，如mRNA和小RNA新一代测序，有望通过发现新的靶点及分子标记物进一步强化甲状腺癌的精准诊疗。超声介导的FNA细胞学检查联合分子标记物检测对甲状腺结节的鉴别诊断，能够最大限度提高术前诊断的准确率，也为后期治疗及预后判断提供有效的诊断依据。

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