小麦几个多效抗病基因的利用现状及展望

李 玮，宋国琦，张荣志，李玉莲，张淑娟，高 洁，李根英

(山东省农业科学院作物研究所，农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，山东济南 250100)

小麦是世界上仅次于水稻的第二大粮食作物，种植范围广，总面积达2.2亿hm2[1]，以面粉制品为主食的人口占世界人口的35%[2]。流行广、危害重的锈病和白粉病是小麦生产中的主要病害，一旦发病，小麦产量严重降低，给农业生产造成巨大损失。锈病分为条锈、叶锈和秆锈，分别由条形柄锈菌小麦专化型(Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)、隐匿柄锈菌(Pucciniatriticina，Pt)和禾柄锈菌小麦专化型(Pucciniagraminisf. sp.trtici，Pgt)引起；白粉病由禾本科布氏白粉菌小麦专化型(Blumeriagraminisf. sp.tritici，Bgt)引起[3]。当前，选育抗病品种是防治小麦锈病和白粉病最经济、有效和安全的途径[4]。小麦的抗病性主要分为垂直抗性和水平抗性两类。垂直抗性又称生理小种专化抗性、全生育期抗性等，由单基因控制，表现为从苗期至成株期均抗病，对病原菌侵染产生免疫或坏死反应。但是在抗病品种的选择压力下，病原菌生理小种此消彼长，抗病品种的抗性会逐步丧失。因此近年来人们对水平抗性的研究和利用越来越多。水平抗性又称部分抗性、非小种专化抗性、成株抗性等，由微效基因控制，苗期抗病性差，成株期则表现为慢病性，即病原菌侵入潜育期长、孢子堆小、产孢量低等。水平抗性对病原小种无专化性，抗性持久。已经命名的成株抗性基因包括抗叶锈基因Lr12-13、Lr22a/Lr22b、Lr34-35、Lr37、Lr46、Lr48-49、Lr67-68[5]，抗条锈基因Yr11-Yr14、Yr16、Yr18、Yr29、Yr30、Yr36、Yr39、Yr46、Yr48、Yr49、Yr52、Yr54、Yr59、Yr62[6]，抗秆锈基因Sr2、Sr55、Sr56、Sr57、Sr58[6]以及抗白粉基因Pm38、Pm39、Pm46[7]。大田条件下，小麦病害往往相互叠加，仅对一种病害具有抗性往往不能有效控制病害对产量的影响。在已发现的小麦成株抗性基因中有4个基因同时对3种锈病和白粉病具有抗性，即Lr27/Yr30/Pm？/Sr2、Lr34/Yr18/Pm38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55。多效抗病基因在国内也被称为一因多效基因、兼抗型成株抗性基因等。它们可以应对生产上多病齐发的复杂大田环境，是珍贵的基因资源，如用于培育抗病品种事半功倍。

1 Lr27/Yr30/Pm？/Sr2基因研究进展

1916年，McFadden[8]以六倍体硬红春小麦Marquis选系为父本，与秆锈和叶锈免疫的四倍体二粒小麦Yaroslav选系杂交，后经秆锈病抗性、品质和产量选择培育出小麦品种Hope。在Hope的3B染色体短臂上有1个隐性成株抗性基因Sr2[9-10]，含有该基因的小麦大田成株期表现为慢病性(指小麦植株虽不能完全阻止病菌入侵，但可减缓病害发展速度的一种抗病性)，与拟黑颖病(pseudo-black chaff)紧密连锁[11]，也与幼苗黄化基因sc连锁[12]。2014年，Sr2基因被定位至Hope 3B染色体867 kb区间，包含34个基因，据此预测Sr2不属于NB-LRR基因家族，且不同于已经克隆的Lr34和Yr36[13]。从19世纪40年代以来，Sr2在小麦中得到了广泛使用，为小麦生产提供了持久广谱抗性，在澳大利亚和国际小麦玉米改良中心等的小麦品种中大量存在[10]。

1971年，Rajaram等[14]在澳大利亚品种Timgalen中发现了1个隐性抗叶锈病基因，将其暂时命名为LrT，后被证明该基因与澳大利亚品种Gatcher中的抗叶锈基因相同[15]。1980年，Mcintosh[16]将Timgalen、Gatcher和Hope 3B染色体上的抗叶锈基因正式命名为Lr27，该基因与Sr2紧密连锁，与位于4BS的Lr31基因为互补基因，即2个基因同时存在时才表现抗性[15,17]。Singh等发现3BS上的抗叶锈基因位点对条锈病也有作用[18]，被命名为Yr30[19]。Mago等[17]研究发现之前被认为连锁的Lr27和Sr2可能是同一个基因，该基因还具有白粉病抗性(相应的白粉病抗性基因符号尚未确定，本文用Pm？表示)，Sr2或者说Pm？基因的白粉病抗性有待进一步研究。Lr27、Sr2、Pm？和Yr30为同一个基因的直接证据也需要在Sr2基因克隆之后才能给出。

在分子标记开发方面，Spielmeyer等[20]利用中国春和中国春Hope 3B代换系的F3群体构建了3BS末端遗传连锁图谱，发现SSR标记gwm533可以作为Sr2的连锁标记用于分子标记辅助选择。该标记在含有Sr2的品种中扩增出120 bp片段，在不含Sr2的品种中大部分扩增出155 bp片段或无扩增，个别扩增出假阳性120 bp片段。假阳性片段的SSR重复碱基构成与阳性片段不同，可用STM标记stm559tgag和stm598tcac区分[21]。根据Hope 3B染色体BAC跨叠群开发的连锁CAPS标记csSr2，对不含Sr2小麦材料的检测符合率为100%，对含有Sr2小麦材料的检测符合率为95%(共检测122份材料，115份符合)[22]。Rasheed等[23]根据csSr2的SNP位点开发了KASP标记Sr2_ger9 3p，提高了检测效率。2014年，Mago等[13]将Sr2定位至Hope3B的867 kb区域，候选基因包括10个类萌发素蛋白(Germin-Like Protein)，但在中国春的参考基因组序列中缺失。csSr2位于其中一个类萌发素蛋白上，是已报道距离Sr2最近的分子标记，该基因尚未被克隆。

2 Lr34/Yr18/Pm38/Sr57基因研究进展

Lr34基因源自普通小麦，最早发现于加拿大品种Terenzio并被命名为LrT2[24]，系谱追溯指向巴西品种Frontana，也有学者认为，中国春可能是其最初来源，位于7D染色体短臂。Lr34是成株抗性基因，成株期表现为慢病性，在苗期也有一定抗性，温度低时(日均温0～20 ℃)抗性更好[10]。对叶斑病(Sb1)[25]、稻瘟病[3]、大麦黄矮病(Bdv1)[26]均有抗性，与干叶尖性状(Ltn1)共分离[27]。有报道显示，Lr34与其他基因组合可以显著提高抗性和持久性[28-29]。由于Lr34对多种病害具有持久广谱抗性，在世界范围被广泛应用。

1992年，Singh[30]和Mcintosh[31]分别报道了含有Lr34基因的品种或回交品系具有叶锈病成株抗性，该抗叶锈基因被命名为Yr18，遗传分析显示Lr34和Yr18紧密连锁。2005年，Spielmeyer等[32]发现Lr34基因抗感分离的重组自交系群体在成株期白粉病抗性也分离，遗传作图显示控制白粉病抗性的基因与Lr34和Yr18共分离，该基因被命名为Pm38[33]。2008年，Bansal等[34]检测到稳定的QSr.Sun-7DS与Lr34位点重合，表明Lr34与抗秆锈有关，2011年，Hiebertd等[35]在对加拿大小麦品种Peace的研究也证实Lr34对秆锈病具有抗性，随后将此抗秆锈基因命名为Sr57[36]。

2009年，Krattinger等[37]克隆了Lr34基因，该基因编码ATP结合转运蛋白，其作用机理属于防御性反应，通过产生类似衰老的叶片局部坏死而实现抗病。抗病与感病基因间存在3个多态性位点，即第4内含子的A/T颠换、第11外显子的三碱基缺失和第12外显子的C/T转换[38]。随后根据2个外显子的碱基差异开发了功能标记cssfr1-cssfr6。在对功能标记验证时发现，Jagger和H45属于感病品种，但检测结果为抗病基因型。序列分析发现，Jagger的Lr34基因外显子22上发生了G/T转换产生提前终止密码子，缺失了C端的185个氨基酸导致基因功能丧失。据此开发了区分假阳性Jagger类型的CAPS标记cssfr7[39]。2010年，Dakouri等[40]通过图位克隆方法再次确认了Lr34为ATP结合转运蛋白基因，开发了功能标记caIND11并发现了稀有变异类型。2016年，Rasheed等[23]开发了检测三碱基缺失和Jagger类型G/T转换的KASP标记Lr34_TCCIND和Lr34jagger，提高了检测效率。

3 Lr46/Yr29/Pm39/Sr58基因研究进展

Lr46基因发现于国际小麦玉米改良中心(CIMMYT)小麦品种Pavon76，位于1B染色体长臂，部分显性，属于成株抗性基因，但抗性效应小于Lr34。基因定位发现，Lr46的连锁AFLP标记与1个抗条锈病基因也连锁，将该抗条锈病基因命名为Yr29[41-42]。Lr46对叶斑病有抗性但效应较小[25]，与干叶尖性状(Ltn2)共分离[43]。2008年，Lillemo等[33]对CIMMYT小麦品种Saar进行抗白粉病基因定位时发现其含有Lr46/Yr29位点，并且该位点具有白粉病抗性，将其命名为Pm39。2013年，Singh等[44]报道Lr46/Yr29/Pm39/Ltn2可能还具有秆锈病成株抗性，该基因被命名为Sr58[45]。虽然Lr46与Lr34很类似，但是没有证据表明它们所在的7DS和1BL发生过基因复制或染色体片段复制，两者应该是不同基因。

在分子标记开发方面，利用连锁标记和小麦染色体缺失系Lr46被定位至1BL 0.84～0.89染色体区段，与水稻5L染色体有共线性关系。根据共线性区段的小麦EST开发分子标记，在Lalb×Lalb(PRL 1B)群体中筛选出XSTS1BL2和XSTS1BL17位于Lr46两侧各2.2 cM，XSTS1BL9与Lr46共分离[46]。Rosewarne等[43]在Lalb×Lalb.(Pavon 1B)和Lalb×Lalb.(Parula 1B)2个群体中发现STS标记BAC17R距Lr46位点2～3 cM。根据SNP位点开发的CAPS标记cslv46可以有效区分抗病鉴定含或者不含Yr29的近等基因系，是目前检测Lr46最有效的分子标记[47-48]，该基因尚未被克隆。

4 Lr67/Yr46/Pm46/Sr55基因研究进展

1979年，Dyck和Samborski[49]在编号PI250413的巴基斯坦普通小麦中发现1个成株抗条锈基因，通过回交法将该成株抗条锈基因导入Thatcher获得品系RL6077。由于与Lr34抗病反应相似，被推测是Lr34的染色体易位。细胞学研究否定了7D染色体发生过易位，关联分析在2个用RL6077组配的分离群体中检测到4DL上存在叶锈和条锈成株抗性位点，其中叶锈成株抗性基因被命名为Lr67[50]。2011年，Herrea-Foessel等[51]利用RL6077与感病亲本Svocet S组配的群体进行了研究，验证了Lr67并确定Lr67与Lr34是不同基因，将与其共分离的抗条锈基因命名为Yr46，同时发现Lr67/Yr46具有秆锈病抗性且与干叶尖性状紧密连锁，随后他们又进一步研究了RL6077抗秆锈、白粉病和干叶尖性状的关系，结果表明，Lr67/Yr46具有秆锈和白粉病抗性，并且与干叶尖连锁，将其对应基因分别命名为Sr55、Pm46和Ltn3[52]。

2015年，Kolmer等[47]克隆了Lr67基因，该基因编码一个己糖转运蛋白，其作用机理为营养限制，即通过抑制质外体途径的己糖转运，使叶片中已糖比例升高，蔗糖比例下降，限制病菌对蔗糖的获取，从而抑制病菌的生长。抗病与感病基因编码的己糖转运蛋白仅存在2个氨基酸的差异，对葡萄糖摄取具有显性负效应。该基因的抗病性可能是通过改变葡萄糖转运来减少葡萄糖摄取，从而减缓病菌生长。根据差异氨基酸位点的DNA序列设计了TM4和TM10两个SNP功能标记，是用于分子标记辅助选择育种的理想标记。

5 多效抗病基因的载体材料与利用情况

含有Sr2基因的原始材料为Hope和H44-24[8]，经分子标记csSr2检测含有该基因的材料还包括Sunstate、Opata、Pastor、Pavon76等[22]；Lr34基因存在于PI58548、中国春、川麦18、RL6058、Frontana、Glenlea、Opata等小麦材料中[38，53]；Lr46基因发现于CIMMYT材料Pavon76[41]，含有该基因的材料还包括Attila、Parula、Saar等[33-43]；Lr67基因来源于编号PI250413的巴基斯坦小麦[49]，后被导入RL6077[50]，Sujata和NP876也含有该基因[54]。

杨文雄等[55]2008年对中国的231份小麦育成品种(系)进行Lr34基因检测，发现14份携带Lr34基因，占6.1%。Zeng等[56]2014年对330个品种和164个高代系进行检测，发现2.0%的材料含有Yr18基因。Ren等[57]2015年对84份品种或高代系进行基因推导，认为13份材料含有Lr27基因，占检测总数的15.5%。刘金栋等[58]2015年对成株抗性高代品系进行检测，发现21份冬小麦中有3份含基因Sr2或Lr34或Lr46，没有同时含2个以上基因的材料；96份春小麦中有9份同时含基因Lr34和Lr46，同时含基因Sr2和Lr46的有2份，同时含基因Sr2、Lr34和Lr46的仅1份。Moore等[54]2015年利用Lr67功能标记对115个中国地方品种进行检测，发现仅3个品种含Lr67基因。刘理森等[23]2016年对241份小麦品种(系)进行检测，发现59份材料含基因Pm38，占24.5%。张亚琦[59]2016年对460份常见小麦品种进行分析，发现59份品种含基因Lr34，占12.8%，89份品种含基因Lr46，占19.3%，11份品种同时含这2个基因，占2.4%。Rasheed等[23]2016年对223份中国大面积种植的小麦品种进行检测，发现6份品种含基因Lr34，占2.7%；69份品种含基因Sr2，占30.9%；4份品种同时含这2个基因，占1.8%。以上研究说明，中国小麦育种材料含基因Lr34的最多，含Lr46或Sr2的次之，含Lr67的极少，同时含2个以上多效抗病基因的小麦品种仍较少。

中国小麦品种中多效抗病基因分布频率较低，可能原因有3个：一是对多效抗病基因的重视不够，一般仅作为成株抗病基因针对一种病害进行选择，而忽略了其多效性；二是多效抗病基因单个基因的抗性表现不佳，中国小麦育种当前还是以常规育种为主，选育过程中追求高抗，多效抗病基因容易丢失；三是还未对多效抗病基因聚合后的效应开展系统研究，不同基因数量和组合对小麦抗病性、农艺性状和品质性状的影响尚不明确，影响了育种利用。

6 研究展望

近年来，全生育期抗性品种因病原生理小种变化丧失抗性频繁发生，CIMMYT对成株抗性的系统研究和育种实践表明聚合4～5个微效成株抗性基因可以培育出持久抗性品种，有效减少产量损失。通过聚合Lr34、Lr46和Lr67等若干基因，获得兼抗型持久抗性是CIMMYT小麦抗病育种的主要策略，美国、澳大利亚和欧洲也正在开展成株抗性研究或生产应用[60]。CIMMYT和欧美对多效抗病基因利用的成功为中国小麦抗病育种指明了的方向。20世纪80年代以来，中国的育种家开始进行小麦成株抗性鉴定，相继发现了豫麦2号、小偃6号、豫麦47、百农64和鲁麦21等大面积推广的成株抗性品种[60]。与国外相比，当前中国的小麦成株抗性的研究和应用尚处于起步阶段。四川省农科院与CIMMYT合作开展小麦育种始于2000年，2012年育成了96份成株抗性春小麦品系[58]。阳 霞等[61]将RL6077携带的多效抗病基因导入西农979，分析了其与农艺性状的关联性，获得了抗病新种质。中国农科院作物所何中虎研究员多次在会议上强调多效抗病基因的重要性，并借鉴CIMMYT成熟的成株抗性育种方法，开展了抗条锈病和抗白粉病育种尝试，提出了兼抗型成株抗性育种方法，为多效抗病基因的育种利用提供了参考。含有多效抗病基因的小麦种质材料被引入中国多年，但聚合2个以上多效抗病基因的小麦品种并不多。对成株抗性的深入研究，特别是Lr34基因功能的深入研究，改变了育种家对多效抗病基因的认识，功能分子标记的开发为分子标记辅助选择育种扫清了障碍。在中国小麦品种(品系)中已发现基因Sr2、Lr34和Lr46，应通过分子标记对其进行选择，并与其他抗病基因组合利用。基因Lr67在中国利用较少，与受体亲本Thatcher相比，含有Lr67的回交品系RL6077叶锈抗性明显改善，且产量等农艺性状和品质性状均无明显差异，表明其对产量和品质性状没有负效应，在育种上的应用值得期待，应加强该基因在中国小麦育种中的利用。有效利用已有的多效抗病基因，鉴定和克隆新基因，将会为中国选育兼抗型持久抗性小麦品种奠定坚实基础。