转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状

廖 莎，李国玲，吴珍芳，李紫聪

（华南农业大学动物科学学院/国家生猪种业工程技术研究中心，广东 广州 510642）

自1982年美国华盛顿大学Palmiter等［1］将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里得到比正常体格大一倍的“超级老鼠”，以及在1983年研究出第一例转基因作物烟草［2］以来，越来越多的科研人员开始进行转基因的相关研究工作。经历30多年的发展，随着克隆技术和基因编辑技术逐渐发展成熟，转基因动物和转基因植物的研究变得更为广泛，“转基因”一度成为研究热词。转基因动植物的应用主要包括品种改良、提高抗病能力、动物疾病模型、医院器官移植、作为生物反应器等。随着医疗科技的发展，人们对重组蛋白药物的接受度增高，同时人们对这类药用蛋白的需求量也持续增加，传统生产重组蛋白的方法已经不能满足人们的需求量，必须寻求更高效的生产药用蛋白的方法，而转基因动植物的出现为此提供了一个契机。科学家提出利用转基因动植物的某些器官组织来表达外源目的蛋白，通过构建合适的载体，选择适当的启动子和调控序列可产生高于正常表达水平的重组蛋白，并能在活体动植物上持续不断地收集纯化出来，从而获得大量目的蛋白。相较传统生物反应器（微生物和细胞系统），利用转基因动植物生物反应器生产药用蛋白具有更广阔的商业前景，因为转基因动植物表达的外源蛋白活性高、质量好，产量高、易提纯，且这些转基因动植物可以不断扩繁，源源不断生产珍贵的药用蛋白；其次，转基因动物的制备成本相对较低，而生产的药用蛋白大多都很昂贵且需求量大，因此经济效益高，投资风险小。

至今，转基因动植物生物反应器研究已经取得多项成果与突破，种类包括乳腺生物反应器（Mammary gland bioreactor）在内的7种动物生物反应器以及20多种植物生物反应器，从中获得的药用蛋白包括人乳铁蛋白（Human lactoferrin，hLF）［3］、 人 血 红 蛋 白（Human hemoglobin，hHb）［4］、凝乳酶［5］、溶菌酶［6］、人生长激素［7-8］、人表皮生长因子［9］、人凝血因子［10］、抗胰蛋白酶［11-12］、单克隆抗体［13-14］、作为疫苗的抗原蛋白等上百种人用或兽用蛋白。根据所需目的外源蛋白质不同的特点，科学家们选择了不同的生物反应器［15］，从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织或器官要便于产物的获得与应用。目前，该领域的很多研究已经进入临床试验阶段，部分产品已获批应用。

本文对转基因动植物生物反应器的研究及其应用现状进行综述，讨论不同类型生物反应器具有的优势及存在的问题，以期为动物和植物生物反应器的深入研究提供参考。

1 转基因动物生物反应器的研究及应用

1.1 转基因动物生物反应器类型

1.1.1 乳腺生物反应器 哺乳动物乳腺生物反应器是目前应用最广泛、研究最深入，且生产外源蛋白最多的，也是目前国际上最早证明可以达到商业化生产水平的动物生物反应器。乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳腺表达基因工程药用蛋白。其原理是将外源蛋白基因连接到乳蛋白基因的调节元件下游，利用乳腺蛋白基因启动子，使外源蛋白基因能够在动物乳腺中特异性过表达，并分泌到乳汁中。早期，Gordon等［16］成功培育出在乳汁中表达具有天然活性的组织型纤溶酶原激活剂（Tissue-type plasminogen activator，tPA）的转基因小鼠。但小鼠乳汁量少，主要作为模式动物进行研究，要进行产业化应用还得开发大型动物。至今，已有多种动物的乳腺生物反应器取得了巨大突破，包括兔、羊、牛、猪等，其表达的外源蛋白产量可观。如1991年Wright等［11］利用转基因绵羊生产药用蛋白——人抗胰蛋白酶，在绵羊乳汁中该酶表达量可高达35 g/L。而Echelard等［17］建立了表达人血清白蛋白的乳腺转基因牛群，其在乳汁中的表达量高达40 g/L，在表达量和表达规模上实现新突破。2015年Cui等［3］在转基因猪乳中成功表达了人乳铁蛋白（hLF）和人溶菌酶（ Human lysozyme，hLZ），表达量分别为6.502 g/L和1.102 mg/L，两者可协同抗菌，在生产中可用于替代抗生素的作用。最近Chevreux等［18］在转基因兔的乳汁中表达了一种新的重组人旁路因子VIIa （FVIIa）——LR769，可有效治疗血友病。

相较于传统生物反应器（微生物和细胞），乳腺生物反应器具有明显优势：一是其合成蛋白的能力强，生产的许多人类蛋白活性高且稳定；二是目的蛋白产量高而生产成本低，且易于收集，而微生物和细胞培养对条件要求高，需要大量昂贵的培养基持续供应，产物收集比较麻烦；三是对转基因动物自身伤害小，因乳腺分泌的特点，其分泌的产物不会进入转基因动物自身循环中，对其自身基本没有影响；四是外源目的基因可以遗传给下一代，获得高水平表达目的蛋白的转基因动物后，可通过人工授精、胚胎分割或体细胞克隆等方法对该转基因动物进行扩繁，进而持续从这些阳性转基因动物乳汁中获得目的蛋白，有利于实现产业化发展，获得巨大经济利润。当然，乳腺生物反应器也存在局限，如只有转基因雌性动物在泌乳期才能收集目的蛋白，具有周期性；某些珍贵药用蛋白仍无法表达；乳蛋白总量高、种类多，对纯化目的蛋白存在一定干扰等。因此，乳腺生物反应器在向产业化发展的过程中也催发了其他生物反应器的研究进程。

1.1.2 血液生物反应器 外源基因在血液中表达的转基因动物被称为血液生物反应器。外源基因编码产物可直接从血清中分离出来，血细胞组分可通过裂解细胞获得。由于血液循环系统与动物的生理活动密切相关，对于某些蛋白因子存在一定的生产限制，利用血液生物反应器只能生产一些对转基因动物健康影响不大的蛋白因子等。例如，Swanson等［4］利用转基因猪血液系统成功表达了人血红蛋白；李维纳等［19］利用原核显微注射法建立了血液中表达人α干扰素的转基因老鼠；Massoud等［12］则利用转基因兔血液获得了重组人抗胰蛋白酶。这类蛋白因子都是血液中本身存在的，对转基因动物的健康不会产生很大影响，有利于对目的蛋白的持续收集。其中大家畜的血液容量较大，更有利于生产。在血液中表达外源蛋白因子可能存在分离纯化困难的问题，可通过敲除内源基因等方式排除高同源性内源蛋白的干扰，使转基因动物将外源基因遗传下去，扩大群体，将有利于向产业化发展。

1.1.3 膀胱生物反应器 外源基因在膀胱中表达的转基因动物被称为膀胱生物反应器，通过收集转基因动物的尿液来获得目的蛋白。膀胱生物反应器的研究目前相对较少，但其作为生物反应器所具有的优势不可忽略：一是尿液产量大、收集方便且不会伤害到转基因动物；二是膀胱生物反应器无周期和性别的限制，在任何时期，雌雄动物均可通过尿液收集目的蛋白；三是外源基因的表达产物基本不会进入血液循环，对转基因动物自身影响小；四是从尿中提取蛋白更容易，因为尿液中含有的蛋白种类及其他杂质相对较少易于纯化。已有报道利用小鼠膀胱表达人生长因子，结果显示该基因在膀胱中的表达表现出很高的专一性［20］，证明了膀胱作为生物反应器生产外源蛋白具有可行性。Zbikowska等［21］利用尿调节蛋白启动子指导人重组促红细胞生成素在转基因鼠尿中表达，表达量达到6 mg/L。然而遗憾的是，能确定在膀胱中特异表达的药用蛋白种类并不多，还需要研究者们进一步探究。

1.1.4 唾液腺生物反应器 唾液腺生物反应器是外源基因在唾液腺中特异表达的转基因动物，通过收集转基因动物唾液获得目的蛋白。同膀胱生物反应器类似，唾液腺作为生物反应器的报道相对较少，但是其具有没有性别及生长周期的限制、易于收集纯化等优点，因此也是生产外源蛋白较好的生物反应器。唾液腺可以特异性表达某些重要外源蛋白因子及酶类，如神经生长因子、植酸酶等。1992年Mikkelsen等［10］利用小鼠PSP（Parotid secretory protein ）基因启动子成功在转基因小鼠唾液中特异性表达人凝血因子Ⅶ。最近曾芳等［22］已经成功从转基因小鼠的唾液中制备获得人源神经生长因子并证明了其生物活性。之前Golovan等［23］曾利用猪唾液腺成功表达了植酸酶，使饲料中磷的利用率得到提高，同时降低了猪粪便中的磷含量，减少了对环境的污染，该研究也表明可以用猪唾液腺获取高产量药用蛋白。前期研究的成功也为后续研究的可行性提供了有利证明。

1.1.5 家禽输卵管生物反应器 家禽输卵管生物反应器主要是让目的蛋白在输卵管中特异表达，并能在禽蛋中收集。家禽输卵管能为一些外源蛋白提供正确的翻译后修饰，且禽蛋产量高、周期短，蛋清成分也相对简单，易于纯化分离外源目的蛋白。目前主要研究的是鸡输卵管生物反应器。外源基因表达产物在输卵管特异表达后转入蛋中，不会进入到转基因鸡的循环系统中；还可通过制备SPF（Special pathogen free）鸡来避免人畜共患病的风险，是比较理想的生物反应器，具有巨大潜在商业价值。中国农业大学的Cao等［6］构建了慢病毒载体，显微注射入鸡胚X期胚盘下腔，成功获得了人溶菌酶表达量高达57.66 μg/mL的转基因鸡。Park等［9］成功获得在输卵管表达人表皮生长因子的转基因鸡。最近Kwon等［24］也成功获得在输卵管特异表达人类促红细胞生成素（hEPO）的转基因鸡。鸡输卵管生物反应器的研究虽已取得较大进展，但还未与定点整合、稳定遗传的转基因技术很好地结合起来，其中发展相对较为成熟的逆转录病毒法也还存在一定安全风险和效率低下等问题，要想实现产业化，制备转基因家禽的技术还有待进一步研究和优化。

1.1.6 其他类型动物生物反应器 其他类型的动物生物反应器还有精囊腺和家蚕等。对于某些动物（如猪）而言，精液是量相对较大的体液，利用精囊腺也可以特异表达某些外源蛋白。Dyck等［8］证明了小鼠雄性附属性腺特异性启动子P12基因可用于生产在精囊上皮细胞中表达人生长激素的转基因小鼠，该转基因小鼠的精液中的人生长激素浓度可达0.5 mg/mL。宋成义等［25］成功以猪精浆蛋白Ⅱ基因启动外源目的蛋白或多肽在精囊腺中特异性表达并分泌到精液中，通过收集精液获取目的蛋白。因表达的目的产物不会进入转基因动物的血液循环等，对转基因动物的健康影响不大，因此精囊腺作为生物反应器具有巨大的潜在利用价值。但目前研究相对较少，表达的外源蛋白也有限，实现产业化较为困难。

转基因家蚕生物反应器是在家蚕丝腺中表达外源基因，在蚕茧中收集目的蛋白。主要利用家蚕的杆状病毒（BmNPV）表达系统结合piggyBac转座子介导法进行操作来表达外源蛋白。该方法能高效整合外源基因，并在家蚕体内稳定高水平表达。家蚕生长周期短，经驯养、选育已难以逃逸到自然界，其在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力，合成的蛋白可随蚕丝蛋白一起分泌到体外。Song等［26］利用转基因家蚕丝腺制备的类胰岛素生长因子（Human insulin-like growth factor-Ⅰ，hIGF-Ⅰ）有效降低I型糖尿病小鼠的血糖水平。Wang等［27］成功制备了能在蚕茧中高水平表达重组人酸性成纤维生长因子（Recombinant human acidic fibroblast growth factor，r-haFGF）的转基因蚕，且证明了其产物的生物活性。利用家蚕生物反应器生产药用蛋白也将会是一种有效途径，相关研究已开展临床试验。

1.2 转基因动物生物反应器应用现状

人们对于各类药用蛋白的需求日益增加，促使生物反应器制备药用蛋白开始向产业化发展。目前，进入临床试验的动物生物反应器生产的药用蛋白已达上百种，部分转基因动物生物反应器制得的药用蛋白已获批生产上市。

1.2.1 已获批上市的动物生物反应器 目前，已知获批上市的转基因动物乳腺生物反应器主要有两个。一个是世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn）。2006年该药首次获得了欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）人用医药产品委员会的上市批准，随后在2009年获得了美国食品与药品管理局（Food and drug administration，FDA）的上市批准。该药是GTC Biotherapeutics生物公司利用转基因山羊的乳腺作为生物反应器表达获取的，其主要成分重组人抗凝血酶Ⅲ具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。他们现在仅用几十只转基因山羊就能生产出全世界1年需求的抗凝血酶Ⅲ。该药品的上市掀起制药业的一场革命，开辟生物制药业的新纪元。转基因动物乳腺生物反应器制药将逐渐取代低效的细菌发酵制药和高成本的哺乳动物细胞制药，成为最主要的基因工程制药技术。

另一个是荷兰Pharming公司研发的转基因兔乳中生产的重组人C1抑制剂（Recombinant human C1 esterase inhibitor protein，rhC1INH，商品名：RUCONEST），该转基因药用蛋白于2010年被EMA批准上市，2014年被美国FDA批准上市。RUCONEST主要适应症包括治疗成年人及青少年遗传性血管性水肿以及功能延迟恢复缺血性再灌注损伤。另外该药也正在进行针对治疗2～13岁的儿童遗传性血管水肿和急性发作血管性水肿的Ⅱ期临床试验研究。

另外，Alexion Pharmaceuticals公司利用鸡输卵管作生物反应器生产的用于治疗溶酶体酸性脂肪酶缺乏症（Lysosomal acid lipase deficiency， LAL-D）的药物Kanuma，目前已被FDA、欧盟以及日本批准上市。Kanuma是一种重组人溶酶体酸性脂肪酶（Recombinant human lysosomal acid lipase，rhLAL）蛋白，在转基因鸡蛋的蛋白中提取制备。这是除了乳腺生物反应器以外新获批上市的动物生物反应器，预示着未来也许将有更多动物生物反应器获批生产应用。

1.2.2 已批准进行临床试验阶段的动物生物反应器 国外多家公司利用转基因动物乳腺生产的多种药用蛋白已经取得了前期试验的成功，进入了临床研发阶段，其中几家上市公司尤为突出。

GTC公司（后被LFB公司收购）除了已获批的人抗凝血酶外，还有利用羊乳腺生产的甲种胎儿球蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP，MM-093）进行了对自身免疫疾病的临床Ⅱ期试验。另外，生产的用于治疗肺纤维囊肿的抗胰蛋白酶（AAT）、治疗烧伤和血量扩积的血清白蛋白、单克隆抗体CD20和CD137（4-1BB）以及疟疾疫苗均已基本完成临床前期阶段；利用兔乳生产的人凝血因子Ⅶα已进入了临床Ⅲ期试验。

荷兰Pharming公司除了已获批上市的RUCONEST以外，还有利用奶牛乳腺作生物反应器生产的乳铁蛋白，目前已基本完成临床前期试验阶段，主要应用于营养制剂；利用转基因兔和转基因牛乳腺生物反应器生产的胶原蛋白等也进入了临床前期试验阶段。

英国PPL公司利用绵羊乳腺生物反应器生产的抗胰蛋白酶已完成临床Ⅲ期试验，生产的血纤维蛋白原进行临床Ⅲ期试验，生产的蛋白C进入临床Ⅰ期试验。PharmAthene公司利用转基因山羊乳腺生物反应器生产的丁酰胆碱酯酶（Protexia—butyrylcholinesterase）在治疗有机磷中毒上已进入临床Ⅰ期试验，在治疗老年痴呆上已进入临床前期试验。BioSidus公司利用转基因山羊乳腺生物反应器生产的生长激素已进入临床Ⅰ期试验。ProGenetics公司利用猪乳腺生物反应器生产的人凝血因子Ⅸ完成临床前期试验。

而在国内，获批试验的生物反应器生产的药物极少，大部分研究还处在临床前的探索阶段。主要由于一些哺乳动物研究周期相对较长，存在技术上的挑战，国内审核也较为谨慎，因此产业化进展缓慢。但在一些研发周期较短且研究技术成熟的动物上也取得了一些产业化进展。例如，张耀洲等［28］完成了利用家蚕蛹生物反应器生产的人粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hGM-CSF）口服给药的临床前安全性评价；2010年浙江大学的张文平等［29］完成了该研究的Ⅰ期临床试验，实现了在国内外首次以家蚕作为生物反应器生产人用生物制品的突破。

动物生物反应器生产重组蛋白的优势以及带来的经济价值，不断推动动物生物反应器制药向前发展，国内外各大生物科技公司及相关科研机构将继续对转基因动物生物反应器生产药物蛋白进行新的研究与试验，未来将会有更多动物生物反应器生产的重组药用蛋白获批应用。

2 转基因植物生物反应器的研究及应用

2.1 转基因植物生物反应器概述

植物作为真核表达系统，可以表达具有生物活性的人类或动物蛋白，因此在生物反应器研究领域也一直是研究热点。植物生物反应器广义上指以植物悬浮细胞培养或整株植物为工厂大量生产具有重要功能的蛋白质，如人或动物用疫苗、抗体和重要的氨基酸等。与其他生物反应器（微生物生物反应器和动物生物反应器）相比，植物细胞具有全能性，能够再生植株且易于成活，用作生物反应器具有成本更低、周期更短、安全性好、利于规模化生产以及表达产物具有与高等动物细胞一样的免疫原性和生物活性等优点，且不存在有关转基因动物伦理道德的问题。早在20世纪80年代末，人们在研究动物生物反应器的同时也将目光放在了植物生物反应器上。1986年Barta等［30］在烟草和向日葵中将激素与农杆菌胭脂碱合成酶进行融合表达，实现了首次使用植物表达系统生产药用蛋白；1989年Hiatt等［13］第一次使用烟草表达抗体；1997年Curtiss等［31］利用转基因烟草表达链球菌变异株SpA蛋白（一种表面蛋白抗原），这是第一例利用植物表达系统生产疫苗。之后陆续有研究报道了各种转基因植物生物反应器生产疫苗、抗体、激素因子等外源产物，至今已有大约20多种植物被用作生物反应器，产物种类近百种。根据产物需求的不同，选择哪一种植物作为生物反应器是研究者们首先要考虑的问题，目前农作物是应用比较多的一类植物生物反应器。

2.2 植物生物反应器应用现状

2.2.1 生产疫苗 目前植物生物反应器生产疫苗是一个比较热门的研究方向。传统疫苗生产和纯化过程较为复杂和昂贵，在运输和储存过程中必须冷藏，这进一步增加了疫苗生产的下游成本。用转基因植物作生物反应器生产疫苗具有可当地种植、常温储藏的天然优势，将降低疫苗制作的下游成本。烟草是较早开始研究的转基因植物，常作为研发疫苗等外源蛋白表达的模式植物。利用烟草作生物反应器生产目的蛋白的研究最为广泛，用它表达的疫苗种类多达20种以上，包括如抗登革热病毒［32］、霍乱毒素［33］、狂犬病病毒［34］、鼠疫杆菌［35］等。除了烟草，还有如拟南芥等植物作为植物生物反应器开发疫苗的模式植物，用以表达的疫苗有猪瘟病毒［36］、猪繁殖与呼吸综合征病毒［37］、人轮状病毒［38］疫苗等。

与不能直接食用的植物生物反应器生产疫苗相比，可食用植物生产疫苗更具有优势和应用前景。利用植物可食用部分表达疫苗抗原蛋白，通过直接口服的方式获得抗原蛋白，使机体产生免疫效应，称之为“口服疫苗”。经研究证明，“口服疫苗”食用后可同时引起粘膜免疫反应与血清免疫反应，在消化道内植物细胞壁能够保护疫苗抗原不被消化酶降解，直到肠道微生物降解植物细胞壁后，抗原被释放出来，引发免疫反应［39］。与传统注射疫苗免疫相比，“口服疫苗”具有更多优势，我们可以通过吃蔬菜、水果等植物性食品就可以获得免疫抗体，养殖的动物也可以通过饲喂的方式进行防疫工作，节省了注射疫苗的成本和劳力等。该新型简单有效的免疫接种方式一出现就成为科学家们关注的热点。已报道转化成功的口服疫苗植物有番茄［40］、马铃薯［41］、莴苣［42］、胡萝卜［43］、花生［44］、玉米［45］、菠菜［46］、白三叶草（畜禽饲喂）和苜蓿［47］等。对于人而言，考虑到有些植物不能直接生食（如马铃薯），而加热可能破坏免疫原蛋白，研究口服疫苗更趋向于利用可直接生食的植物，如番茄、苹果、花生、香蕉和胡萝卜等。对于家畜的饲用疫苗，可选用苜蓿、大豆和玉米等作为受体植物，使抗原蛋白积累于种子、叶子等天然蛋白贮藏器官中或整株植物体中。最近，Bertini等［48］用菠菜和红甜菜作生物反应器制备谷氨酸脱羧酶（GAD65），用于预防自身免疫疾病Ⅰ型糖尿病，证明红甜菜效果更佳。诸多研究成果推动了“口服疫苗”临床应用的发展。

目前，已有十多种疫苗获批应用或进行临床试验。如美国陶氏益农（Dow AgroSciences）公司利用烟草生产新城疫病毒的疫苗已被美国农业部批准使用，该疫苗是第一个获得批准的用于预防禽类的新城疫病毒的兽用植物疫苗。由美国Bayer Innovation公司研发的用烟草制备的治疗非霍奇金淋巴瘤癌症疫苗已进入临床Ⅲ期试验。Medicago公司利用烟草、马铃薯、番茄、玉米、莴苣、菠菜等植物研发的H5N1疫苗已完成临床Ⅱ期试验［49］。由美国Arizona State大学研发的利用马铃薯制备的乙肝疫苗抗原已经进入临床Ⅱ期试验，利用马铃薯和番茄制备的Norwalk病毒衣壳蛋白进入临床Ⅰ期试验。Thomas Jefferson大学利用莴苣和菠菜分别研发的乙肝疫苗抗原和包含狂犬病抗原表面的融合蛋白已进入临床Ⅰ期试验。Guardian biosciences公司利用油菜籽研发的抗球虫病的家禽疫苗进入临床Ⅱ期试验等。利用植物生产疫苗正越来越受到关注，就目前取得的成果来看，植物来源的疫苗有广阔的应用前景。

2.2.2 生产抗体 为更好地利用植物生物反应器解决药物生产量的不足及快速免疫问题，科学家采用的另一个策略是利用植物表达特定抗体。将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，即可在植物中表达出具有功能性识别抗原及具有结合特性的全抗体或部分抗体片段；植物细胞不但可以对表达的重组抗体蛋白进行正确的组装和后期加工，其表达产物能保持良好的生物学特性，而且植物表达的抗体以二聚体形式存在，表达产物的亲和力高，有助于全面发挥抗体的功能。2000年Stöger等［50］利用谷类（水稻、小麦）成功表达了针对癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen ，CEA）的单链Fv抗体，表达量达30μg/g，实现了从烟草等模式植物系统到谷物类农作物的转变。2005年Hull等［14］利用烟草成功制备了治疗炭疽的单克隆抗体。近年来也有许多科学家利用植物制备了具有生物活性的抗体。如Phoolcharoen等［51］在烟草中瞬时表达狂犬病中和单链抗体和狂犬病病毒肽融合蛋白，该蛋白可穿过纤维素血脑屏障去中和狂犬病毒，可为狂犬病提供更有效的紧急预防。Julve等［52］利用烟草成功制备重组蛇毒多克隆抗体，可用于制备低成本抗蛇毒血清抗体。在临床应用研究方面，美国PB（Planet Biotechnology）公司利用烟草研发的单克隆抗体（CaroRxTM），主要应用于阻止导致蛀牙的细菌对牙齿的粘附，有预防龋齿的作用［53］，目前已被欧盟批准应用。CIGB公司用烟草研发的用于B型肝炎疫苗试剂的纯化的重组单克隆抗体已被古巴批准上市。NeoRx/Monsanto公司利用玉米研制的癌症抗体进入临床Ⅱ期试验；Bayer Innovation公司利用烟草研制的治疗非霍奇金淋巴瘤的IgG抗体已进入临床Ⅰ期试验；Pharma-plantaconsortium公司利用烟草研发的预防艾滋病的抗体2G12已获批进入临床Ⅰ期试验阶段［54］；Biolex公司利用浮萍作生物反应器研发的Anti-CD20单克隆抗体用于治疗非霍奇金淋巴瘤，目前已准入临床前期试验；Thomas Jefferson大学利用生菜研发的B型乙肝表面抗体开展临床Ⅰ期试验。美国Mapp公司利用转基因烟草表达了3种抗埃博拉病毒的人鼠嵌合单克隆抗体mAbs进行“鸡尾酒”疗法，该试验性抗体药物名为ZMapp，2014年8月《Nature》报道了该药治愈了18只感染埃博拉病毒的恒河猴［55］，为抗埃博拉药物研发带来了新希望。

总之，利用转基因植物生产抗体已取得许多成效，对未来制备低成本、高产量的特异性抗体提供了新思路、新途径，更多治疗性抗体有待研究人员进一步研究。

2.2.3 生产其他药用蛋白 利用植物作为生物反应器，除了用于生产了那些传统方法难以获得的疫苗抗体外，还表达了其他类型的药用蛋白，如各种酶制剂［56］、激素［7］、血蛋白［57］、生理营养因子［58］等。首先实现商业化生产的植物源药用蛋白是以色列药品研发公司Protalix开发的在胡萝卜细胞中表达的葡糖脑苷脂酶，于2012年被美国FDA批准上市，主要用于治疗β-葡萄糖脑苷脂酶减少或缺乏引起的一种遗传代谢病高雪氏病（Gaucher’s disease），其价格要比天然来源的药物更便宜。此外，已获批上市的还有ProdiGene公司和Kentucky BioProcessing公司分别利用玉米和烟草研发的抑肽酶，以及ProdiGene公司利用玉米研发的抗生物素蛋白（Avidin）和β-葡糖醛酸酶（GUS），Ventria Bioscience公司利用玉米和水稻研发的重组人乳铁蛋白（Lacromin），加拿大SemBioSys公司利用红花（safflower）研发的虾饲料添加剂Immunosphere，ORF Genetics公司利用大麦研发的人生长因子ISOkine、DERMOkine，Meristem Therapeutics公司利用玉米研发的治疗囊性纤维化的胃脂肪酶，Cobento AS公司利用拟南芥研发的人内因子（用于治疗维生素12缺乏）等均已获批上市销售。另外也有多家公司研发的其他转基因植物表达的药用蛋白获批临床试验，如SemBioSys公司已于2008年开始用植物（红花种子）制胰岛素进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验，目前已进入临床Ⅲ期试验；还有Protalix公司利用胡萝卜细胞研发的乙酰胆碱酯酶已进入临床Ⅰ期试验等。除了这些已获批临床试验的植物源人用蛋白，还有许多其他相关研究在开展临床试验前的准备工作。与动物生物反应器相比，植物生物反应器的产业化进展似乎推进得更快。

3 展望

近几十年来，基因工程药物产业蓬勃发展。全球生物技术公司总数已近5 000余家，上市公司有600余家，销售总额近400亿美元，其中生物技术药物占总销售额的70%。就目前已上市的转基因生物反应器的产品销售额来看，因需求增加，预计销售额将持续增加。虽然转基因生物反应器取得了许多巨大的成果，但是仍然有许多问题需要面对和解决。首先，对于转基因动物生物反应器而言，存在理论和技术尚有不完善之处：一是非定点整合技术（如piggyBac转座子介导）存在目的基因整合位点的不确定性，不能完全保证在预期位点，有可能出现片段缺失、调节失控、遗传不稳定等问题，而新型定点打靶基因编辑技术，如锌指核酸酶（Zinc finger nuclease，ZFN）技术［59］、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcriptional activator like effector nuclease，TALEN）技术［60］、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术［61］也有打靶效率较低、脱靶的问题；二是转基因动物的克隆效率低，尤其是较大的哺乳动物，低下的体细胞克隆效率极大地阻碍了转基因动物的生产，要获得更多转基因动物必然会增加时间和资金的投入成本；三是安全性问题，插入外源基因首先是存在转基因动物逃逸继而污染野生型基因的风险，其次是转基因动物生物反应器产物可能存在免疫原性问题以及人畜共患病等风险；四是动物生物反应器产物的收集与纯化技术的问题，既要保证收集纯化到足量的目的产物，又要确保对转基因动物不会有太大影响，要同时满足这些要求对动物生物反应器的选择是个挑战。

对于转基因植物生物反应器而言，存在的主要问题有：一是表达产物的量普遍偏低［62］，增加了下游加工的成本，很难实现产业化水平，同时在生产疫苗应用方面，表达量低下可能导致免疫耐受问题；二是免疫原性问题，因为植物的糖基化与动物的有差异，某些植物源性的药用蛋白可能会使人产生过敏反应［63］；三是植物表达系统针对性强，由于不同植物和不同组织的生理差异较大，因此单一的表达系统只适合生产几种甚至一种目标产品。在应用过程中不同植物生物反应器存在一定差异，如何选择最适表达系统是成功生产植物生物反应器药用蛋白的重要一环；四是有安全性问题，转基因植物要防止被动物误食或带出实验室进而污染外界野生型植物基因。

目前被真正批准生产应用的动植物生物反应器并不多，而限制动植物生物反应器产业化应用的原因主要是因为转基因产品一直存在争议，公众的舆论让政府审批也很保守，转基因药品的产业化与批准上市涉及多个监管部门，特别是我国相关领域监管空白，法规政策缺乏，转基因药品产业化更是落后。另外未将药品审评与动物审评主管部门集中在一起，导致相应的工作难以协调。但随着日益发展的科技，相信科学家们能一步一步解决理论与技术上存在的问题，不断完善转基因动物生物反应器的制备方法，提高转基因药用蛋白的产量。转基因动植物生物反应器生产药用蛋白等产品具有光明前景，相信能为企业、为国家赢得更大利润的同时，也为患者谋得福音。