湖北省桑椹腐烂病病原菌鉴定

周建华 朱志贤 李勇 莫荣利 于翠 胡兴明 邓文

摘要：为明确引起桑椹腐烂病的病原菌种类，2017年从湖北省采集病果，采用常规组织分离法进行分离，用分离纯化的菌株进行菌丝块针刺和孢子液注射接种健康果均可致病，形态学鉴定发现其形态学特征与灰霉菌（Botrytis cinerea）一致。在 GenBank进行Blast比对，该菌株的rDNA-ITS序列与Botrytis cinerea和Botrytis fabae相似率最高为99%，用区分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特异性引物进行检测，同时构建分子系统进化树进行分子生物学鉴定，进一步表明该菌为Botrytis cinerea。致病性测定、形态学及分子生物学鉴定结果表明，引起湖北省桑椹腐烂病的病原菌为Botrytis cinerea。

关键词：桑椹腐烂病;致病性测定;形态学鉴定;系统进化树

中图分类号：S663.9         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）21-0069-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.016           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Identification of Fruit Rot Pathogen on Mulberry in Hubei Province

ZHOU Jian-huaa，ZHU Zhi-xianb，LI Yongb，MO Rong-lib，YU Cuib，HU Xing-mingb，DENG Wenb

（a.Industry Department/Hubei Sericulture Engineering Technology Research Center;

b.Institute of Economic Crops，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to understand pathogens associate with mulberry rot disease，fruit with rot symptoms were collected from Hubei province in 2017，and the conventional tissue separation method was used to obtain the isolates. Healthy fruits inoculated with purified strain by mycelium plugs puncture and conidia injection both can cause diseased symptoms. Morphological identification showed that the morphological features of the strain were similar to Botrytis cinerea. The Blast search of rDNA ITS sequence of the strain showed 99% sequence identity with Botrytis cinerea and Botrytis fabae in GenBank. The specific primers were used for distinguish Botrytis cinerea and Botrytis fabae，and the construction of molecular phylogenetic tree further confirm the strain was Botrytis cinerea. The results of pathogenicity test，morphological and molecular identification indicated that the pathogen of mulberry rot in Hubei province was Botrytis cinerea.

Key words： mulberry rot;pathogenicity test;morphological identification;phylogenetic tree

桑树是多年生经济植物，在亚洲、欧洲、美洲和非洲广泛种植，过去被用于丝绸产业，但近10多年来，随着桑椹食品与保健品加工技术、生产工艺的发展，以及桑椹采摘游的兴起，以生产桑椹为主要目的的果桑产业快速发展，全国果桑种植面积也不断增加，据不完全统计全国的果桑种植面积达5.33万hm2，桑果产量近80万t[1]。随着种植面积的扩大，病害问题日益突出，极大地影响了桑椹的产量和品质。

湖北省是全国农业区划确定的桑蚕最适宜区域，有4 000多年栽桑养蚕的历史，是全國蚕桑十大省份之一[2]，武汉市、赤壁市、黄冈市、英山县、洪湖市、宜都市等地都建立了果桑基地，果桑规模逐年扩大。在2017年调查中发现，除桑椹菌核病外，桑椹果肉腐烂病发生普遍，发病率5%～20%，病椹初期出现浅褐色病斑，病斑扩展后呈现深褐色水渍状，桑椹小浆果逐渐腐烂，最后整个病椹脱落。为了明确该病的病原，本研究对该病害的病原菌进行了分离、鉴定和致病性测定，以期为病害防治提供理论依据。

1  材料和方法

1.1  病原菌的分离与保存

2017年从湖北省采集发病病果，将发病小核果在75%乙醇中浸泡30 s，在4%次氯酸钠溶液中浸泡1 min，然后用灭菌水漂洗3次，将小核果置于PDA平板上（2%葡萄糖、1.5%琼脂粉，每升培养基加20滴25%的乳酸），于25 ℃恒温培养箱中黑暗培养。然后将分离物转移至新鲜的PDA平板纯化，将纯化的菌株用滤纸片保存于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2  菌株致病性测定

菌丝块致病性测定。将分离纯化的菌株在PDA平板上25 ℃条件下暗培养10 d。用直径6 mm灭菌打孔器打取菌落边缘菌丝块，用无菌注射器针刺花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），将菌丝块置于针刺部位。然后置于铺有3层灭菌吸水纸的9 cm玻璃皿中，25 ℃条件下黑暗培养，每隔1 d观察1次发病情况，以针刺接种PDA培养基的桑椹为试验对照，试验重复3次，每个重复3颗桑椹。待桑椹显现出明显的症状后进行再分离，观察再分离的菌株与原接种菌株在相同培养条件下的形态学特征，进行柯赫氏法则验证。

分生孢子液致病性测定。将分离纯化的菌株在PDA平板上25 ℃条件下黑暗培养10 d。用无菌水清洗菌落，4层擦镜纸过滤分生孢子，8 000 r/min离心5 min，去上清液，用无菌水将孢子浓度调整成1×105个/mL。用无菌注射器吸取100 μL分生孢子悬浮液注射接种花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），以接种无菌水的桑椹为试验对照，后续操作步骤同菌丝块致病性测定。

1.3  形态学鉴定

将保存的代表菌株接种于PDA平板上进行活化，置于25 ℃的恒温箱中暗培养3 d后，用直径6 mm灭菌打孔器打取菌落边缘菌丝块，将其转至新的PDA平板上，25 ℃的恒温箱中黑暗培养，设5次重复，分别于3、5 d测量菌落直径。根据菌落直径计算菌丝生长速度，计算公式：菌丝生长速度（mm/d）=（5 d菌落直径-3 d菌落直径）/2。观察菌株形态、色泽以及是否产生孢子和菌核，在光学显微镜下（Leica，DM500）观察分生孢子形状，并测量其大小。

1.4  分子生物学鉴定

1.4.1  基因组DNA提取  将菌株转入铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央培养，25 ℃条件下培养7 d后收集菌丝。采用CTAB法提取病菌基因组DNA[3]，具体步骤如下：①将供试菌株转入铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央，25 ℃培养5 d后刮取菌丝。将菌丝在液氨中研磨成粉末状，放入1.5 mL EP管中，往EP管中加入65 ℃预热好的CTAB提取缓冲液（2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl）600 μL，混匀后置于水浴锅65 ℃水浴30 min，中间混匀1～2次;②加入600 μL氯仿/异戊醇（24∶1）混匀，12 000 r/min离心10 min;取上清液，重复1次;③2次沉淀后取上清液，加入无水乙醇1.2 mL，在-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min离心10 min;④沉淀用70%乙醇洗2遍，37 ℃风干1 h，溶于50 μL去离子水中，置于-20 ℃保存备用。

1.4.2  rDNA-ITS区的PCR扩增  利用真菌核糖体基因转录间隔区引物对ITS1（5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC

-3′）作为序列扩增和测序引物[4]，引物均由擎科生物科技有限公司合成。PCR反应为总体积50 μL体系，包括2×Es Taq Mastermix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 50 ng 1 μL，加入ddH2O至体系体积达50 μL。将配好的PCR体系在Ti-PCR仪（美国Bio-Rad公司，S1000TMThermal Cycler）上进行扩增。ITS 扩增程序：95 ℃预变性4 min;94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物5 μL与2 μL 6×loading buffer混合（含1‰SYBR GreenI核酸染料，北京百泰克生物技术有限公司），经1.0%琼脂糖凝胶电泳，在Bio-Rad凝胶成像（美国Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+）下检查扩增结果，并委托擎科生物科技有限公司进行DNA纯化和测序。

1.4.3  特异性引物检测  用区分灰霉菌（Botrytis cinerea）和蚕豆葡萄孢（Botrytis fabae）PCR引物（C729+/-：AGCTCGAGAGAGATCTCTGA/CTGCAA TGTTCTGCGTGGAA）[5，6]来对形态学鉴定的菌株进行验证。扩增体系同ITS扩增体系，扩增程序：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min。

1.4.4  系统发育分析  将供试菌株ITS测序结果在DNAMAN软件（Version 5.2.2）中校对拼接后，将测序的DNA序列提交给GenBank，獲得登录号。将DNA序列与GenBank数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中的序列进行比对，选取与其同源性高的序列，采用CLUSTALX（Version 1.83）对序列片段进行比对（alignment）[7]，设定参数。多重序列比对参数：起始空位罚分（gap opening）=10，延伸空位罚分（extension opening）=0.2，转移权系数（transition weight）=0.5，延迟发散序列（delay divergent sequences）=30%。根据需要对结果进行校对[8]。比对后采用MEGA 5.05软件中的最大似然法构建系统进化树，选用Kimura 2 parameter（K2P） substitution模型，进化树用自展分析法进行检验，循环1 000次。

2  结果与分析

2.1  病原菌分离、纯化和保存

2017年从湖北省发生危害严重的果桑基地采集了20份桑椹腐烂病样品（图1），采用常规组织分离法进行分离，均能分离出灰霉属真菌且形态相似。将分离的菌株移至新鲜的PDA平板纯化，用滤纸片法保存于-20 ℃冰箱。以Bg2为代表菌株进行鉴定，本研究中涉及到病原菌的所有试验，均使用该菌株。

2.2  致病性测定

菌丝块和分生孢子液致病性测定结果表明，2种接种方法均可引起桑椹腐烂病发生，接种第3 d可观察到病斑，小核果病斑初期为浅褐色，后期为水渍状深褐色。分生孢子液接种比菌丝块接种发病快，第5天时，菌丝块接种的桑果仅少数小核果变褐腐烂（图2A），而分生孢子液接种的桑椹整颗腐烂，花梗也全部腐烂，在病椹周围形成白色霉层（图2B）。

2.3  病原菌形态学鉴定

Bg2菌株在PDA上菌落呈放射状，中等气生菌丝，4～5 d后菌落四周产生大量分生孢子，呈深灰褐色（图3A、B、C）;后期产生大量微菌核。菌核黑色，圆形、球形或不规则的形状（1.0～5.8） mm×（1.0～4.0） mm。分生孢子聚生于膨大的产孢细胞上（图3D），无隔膜，椭圆形或卵圆形，（3～11.8） μm×（2.2～6.8） μm。培养性状和形态特征与参考文献[9]比对，将病原菌鉴定为灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers. ex Fr.）。

2.4  分子生物学鉴定

2.4.1  ITS 区序列分析  使用真菌ITS区域的引物ITS1和ITS4，对病原菌Bg2进行扩增，获得长度为521 bp的片段，将测序的DNA序列上传到GenBank上（MF445059），测序结果与GenBank NR数据库比对后发现与Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性达99%。

2.4.2  特异性引物检测  用区分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特异性PCR引物（C729+/-）对形态学鉴定为Botrytis cinerea的菌株进行PCR检测，出现特异性扩增的700 bp条带，阴性对照不扩增（图4）。

2.4.3  系统发育分析  在数据库中选取与Botrytis cinerea（MF445059）相近的代表性菌株序列用Clustal X（Version 1.83）进行多序列比对，用 MEGA 5.05软件构建系统进化树，结果表明该菌株与Botrytis cinerea聚为一类（图5）。

3  讨论

根据致病性测定、形态学特征、分子生物学分析结果，将引起桑椹腐烂病的病原菌鉴定为Botrytis cinerea。灰霉病菌寄主廣泛，可危害400多种植物[9]，Martinez等[10]报道灰霉病菌种内培养形状变异较大，具有丰富的多样性。张静[11]对湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢菌多样性研究发现，不同地区或者同一地区不同的分离物，不同寄主或者同一寄主的不同部位所获得的灰霉菌菌株的形态存在很大差异。桑椹腐烂病菌是否存在形态学差异及遗传变异还需多收集更多病样材料进行分离鉴定。

在形态学鉴定的基础上，将桑椹腐烂病菌ITS测序结果与GenBank NR数据库比对后发现，与Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性达99%。Botrytis cinerea和Botrytis fabae形态学差异小，主要区别是菌核及分生孢子大小[5，12]，同时由于灰霉病菌形态学特征受环境和培养条件的影响，所以本研究采用区分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特异性引物（C729+/-）进行PCR验证，该引物扩增Botrytis cinerea产生700 bp大小的条带，而扩增Botrytis fabae会产生600 bp的条带[6]。用该引物对桑椹腐烂病菌进行PCR扩增，同时构建ITS系统进化树进行分子验证，发现该引物只扩增出700 bp的条带，分子系统进化树与Botrytis cinerea聚为一类，分子生物学鉴定进一步说明桑椹腐烂病菌为Botrytis cinerea。

虽然在《台湾产菌类调查报告》的灰霉菌（Botrytis cinerea） 寄主目录中曾提到该病菌寄生于桑树，也有报道桑树灰霉病会造成桑树叶部病害[13];王泽林等[14]报道桑灰霉病主要分布于四川、浙江等蚕区，以四川蚕区发病较重。该病主要在春季发生，为害桑树的新梢、叶片、雄花和桑椹，对桑叶产质量的影响较大;韩蓓蓓[15]从采后腐烂桑椹上分离真菌获得葡萄孢属（Botrytis spp.）霉菌;但是本研究首次分离鉴定了引起桑椹生长期腐烂病的病原菌为Botrytis cinerea。

参考文献：

[1] 赵爱春，余茂德，胡文龙，等.果桑春季菌核病的防控技术[J].蚕学通讯，2017（4）：20-39.

[2] 李祖发，叶建美.对湖北蚕桑产业发展的再认识[J].北方蚕业，2008，29（3）：1-3.

[3] MURRAY M G，THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research，1980， 8（19）：4321-4326.

[4] GLASS N L，DONALDSON G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，61（4）：1323-1330.

[5] MIRZAEI S，GOLTAPEH E M，SHAMSBAKHSH M，et al. Identification of Botrytis spp. on plants grown in Iran[J].Journal of Phytopathology，2010，156（1）：21-28.

[6] RIGOTTI S，GINDRO K，RICHTER H，et al. Characterization of molecular markers for specific and sensitive detection of Botrytis cinerea Pers.：Fr. in strawberry（Fragaria×ananassa Duch.） using PCR[J].Fems Microbiology Letters，2002，209（2）：169-174.

[7] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al. The CLUSTAL_X windows interface：Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997，25（25）：4876-4882.

[8] ZHU Z，ZHENG L，PAN L，et al. Identification and characterization of Fusarium species associated with wilt of Eleocharis dulcis（Chinese water chestnut） in China[J].Plant Disease，2014，98（7）：977-987.

[9] 中國科学院中国孢子植物志编辑委员会.中国真菌志  第二十六卷  葡萄孢属柱隔孢属[M].北京：科学出版社，2006.

[10] MARTINEZ F，BLANCARD D，LECOMTE P，et al. Phenotypic differences between vacuma and transposa subpopulations of Botrytis cinerea[J].European Journal of Plant Pathology，2003， 109（5）：479-488.

[11] 张  静.湖北省灰霉病病菌区系和灰葡萄孢菌多样性研究[D].武汉：华中农业大学，2010.

[12] 黄  燕，段灿星，陆  鸣，等.蚕豆赤斑病病原菌鉴定[J].植物保护，2012，38（6）：115-118.

[13] 顾振芳.桑树灰霉病菌Botrytis cinerea Pers.的生物学特性[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），1986（1）：104-106.

[14] 王泽林，宋友全.桑灰霉病的防治措施[J].蚕学通讯，2014（3）：30-31.

[15] 韩蓓蓓.桑椹病原真菌的鉴定和采后微生物保鲜的研究[D].江苏镇江：江苏科技大学，2016.