超高效液相色谱—四极杆—静电场轨道阱质谱联用法用于宫颈癌患者尿液代谢组学研究

芦晋+任雪+刘相良+刘泽锋

摘要利用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱质谱联用（UHPLCQOrbitrap MS）方法对宫颈癌（Cervical cancer， CC）患者和健康人（Healthy control，HC）的尿液进行分析，研究宫颈癌患者尿液中的潜在标志物，为其发病机制和诊断提供科学依据。筛选11例宫颈癌患者（Age （457± 56） years）及11例健康人 （Age （459± 32） years）尿液样本，采用液相色谱质谱联用技术对尿液进行测定，通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（OPLSDA）处理数据，结果表明，两组人群代谢轮廓有显著差别，发现并鉴定了12种潜在的生物标志物，提示特定的肿瘤代谢途径中潜在的代谢标志物可能在宫颈癌发生发展中发挥重要作用。

关键词宫颈癌；超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱质谱；代谢组学；尿液；生物标志物

1引 言

宫颈癌（Cervical cancer， CC）是最常见的妇科恶性肿瘤，近年发病率有下降趋势，死亡率也有所降低[1]，但有患病年轻化的趋势，其发病机制与生物标志物的筛选和检测是研究的热点。癌变的因素主要包括病毒感染、性行为及分娩次数过多以及卫生条件差等[2]。在临床上早期常无明显症状，部分患者因宫颈外观正常容易造成漏诊或误诊，晚期可引起输尿管梗阻、贫血等全身衰竭的症状[3]。目前，临床上通过病理实验诊断宫颈癌，用于常见的鳞癌、腺癌和腺鳞癌3种类型癌症的鉴别及早期诊断[4]，但这种诊断技术一般会增加患者痛苦，且早期患者诊断准确率不高。

研究表明，RCAS1作为宫颈癌生物标志物具有临床意义[5]。Ralhan等[6]使用iTRAQ标记，利用多维液相色谱和串联质谱技术分析差异蛋白表达，发现和验证了宫颈癌的大分子生物标志物。 Moore等[7]对血清中肿瘤生物标志物HE4在宫颈癌患者体内的生物学作用进行了研究。Diamandis等[8]利用激肽释放酶，发现了人体肿瘤组织中一种新的癌症生物标志物。Trivedi等[9]对宫颈癌和前列腺癌细胞系的癌症生物标志物进行了体外评估。Chen等[10]利用RRLCMS/MS技术，结合统计学方法检测了9种宫颈癌的潜在代谢标志物。关于癌症尿液代谢组学的相关报道促进了癌症疾病检测和发展机制的研究进程[11，12]，然而，目前对于宫颈癌患者的尿液中小分子生物标志物的报道较少。

本研究利用超高效液相色谱四极杆静电场轨道阱质谱联用（UHPLCQOrbitrap MS）[13～15]检测宫颈癌患者尿液中代谢物的变化，通过主成分分析（PCA）法筛选潜在生物标志物，结合病理指标研究宫颈癌的发生发展机制，为宫颈癌早期筛查和临床治疗提供了依据。

2实验部分

21仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000 超高效液相色谱仪和四极杆静电场轨道阱高分辨质谱系统（美国 ThermoFisher 公司产品）；5804R型高速离心机（德国Eppendorf公司）；MilliQ 超纯水系统（美国 Millipore 公司）。尿酸（HPLC 级，南京泽朗生物科技有限公司），乙腈和甲酸（HPLC 级，美国 TEDIA 试剂公司）。

22样本来源及处理

宫颈癌患者尿样和健康人尿样均由吉林大学白求恩第一医院提供，经过吉林大学白求恩第一医院机构伦理委员会批准，所有患者都签署了知情同意书。患者通过病理实验确诊为宫颈癌，11例宫颈癌患者（Age （457± 56） years） 及11例健康人（Age （459 ± 32） years） 尿液样品，清晨空腹收取尿样。采集两组人群尿液样品，3000 r/min离心10 min，除去杂质，于

Symbolm@@ 80℃储存备用。样品室温下溶解，采用离心沉降后的稀释方法[16]，在4℃以12000 r/min离心5 min，取50 μL上清液，用水稀释至200 μL， 涡旋混匀，经045 μm滤膜过滤后，待测。

将所有的宫颈癌患者尿液取等量混合均匀后，按照上述样品处理过程处理，所得作为质量控制样品（Quality control，QC）。将健康人的尿液混合作为参照，每个样品重复测定3次。

23色谱和质谱条件

色谱柱： Thermo Syncronis C18色谱柱 （100 mm × 3 mm， 17 μm），流動相A为01% 甲酸溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序： 0～5 min， 10%～30% B； 5～10 min， 30%～80% B； 10～12 min， 80%～85% B； 12～14 min， 85%～95% B； 14～16 min， 95% B； 16～ 17 min， 95%～100% B。柱温30℃；流速02 mL/min；进样量5 μL。采用电喷雾正、负离子扫描模式；干燥气（N2）流量为9 L/min，温度为350℃； 雾化电压为40 eV；毛细管电压为35 kV；碎裂电压为150 V；锥孔电压为65 V，质量扫描范围m/z 200～1500。

24数据处理

采用Xcalibur对UHPLCQOrbitrap MS检测得到的数据峰校准、背景扣除、面积归一化和数据简化处理。将文件导入EZinfo 20软件OPLSDA 进行多元变量分析。单变量数据统计采用 t 检验（ttest），当 p < 005 被认为数据有统计学意义。多变量数据进行主成分分析，通过PCA得分图（Score plot）获得样本分类信息，通过PCA 载荷图（Loading plot）发现其可作为生物标志物的化合物并予以鉴定。使用生物学数据库HMDB （http：//www hmdb ca）、METLIN （http：//metlinscripps edu）[17]将数据可视化，寻找具有显著特征的生物标志物。endprint

3结果与讨论

31宫颈癌患者和健康人尿液LCMS总离子流图

建立UHPLCQOrbitrap MS分析尿液样品的方法，分别在正负离子模式下进行检测分析。分别将所有宫颈癌患者（Cervical cancer， CC）和健康人（Heathy control， HC）的尿液取等量混合均匀后进行质谱检测， 总离子流图如图1所示。在正负离子模式下，两组人群的尿液的总离子流图存在明显差别，详细的信息进一步采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLSDA）获得。

32数据分析

321主成分分析采用主成分分析统计宫颈癌组和健康组尿样中的代谢物的变化趋势。如图2所示，正离子模式下的PCA 得分图能够很好地区分二者。图2中每个点代表一个样品，每个样品的位置由其成分决定，处于相同生理病理状态的样本通常具有相似的代谢物组成，因此在得分图上也处于相似的位置。相反，彼此之间距离越远，表示其生理病理的状态相差越大。其中，得分图中代表患病组的点较为分散，通过每个点所对应的患者病例二次核查，推断可能是患者治愈期或者类型不同所致。

322差量变异研究基于宫颈癌患者组和健康组的PCA分析结果，确定两组尿液间存在代谢差异。图3为两组样品OPLSDA得分图和正负离子模式下的Splot 载荷图，图中每个点代表样品中代谢物相关信息，距离原点越远的点对两组间区分贡献越大，为两组中差异较大的代谢物。

323潜在生物标志物的鉴定根据精确分子量和 MS/MS 结果以及与 HMDB、METLIN 数据库或标准品进行比较，鉴定尿液中宫颈癌潜在的生物标志物。以m/z 1670184 为例，在负离子模式下，该化合物的提取离子流图和在保留时间 1365 min 时的组分质谱图如图5A和5B 所示。将结果与数据库中化合物进行比对，初步确定该化合物为尿酸。串联质谱的结果（图5C）也证实了这一点，与尿酸标准品的串联质谱离子碎片质荷比结果比对，两者完全一致。根据以上信息，确定其为尿酸。其它化合物采用同样方法鉴定，但仍有一些化合物不能完全鉴定，需要进一步研究。表1列出了潜在生物标志物的鉴定结果。通过分析软件给出了潜在标志物在HC组和CC组之间的变化趋势，标志物的增加或者减少反映了代谢通路的进行方向与趋势。

33代谢通路分析

通过UHPLCMS 方法对宫颈癌患者和健康人尿液进行检测，经统计学计算发现17种潜在生物标志物及变化趋势，并鉴定出尿酸等12种化合物可能与宫颈癌肿瘤的发病机制和代谢途径有关。在体内，嘌呤是核酸的代谢产物，而尿酸是嘌呤的代谢最终产物，因此尿酸是细胞分解的最终产物之一，尿酸测定在宫颈癌并抗利尿激素分泌异常综合征中有重要意义，代谢紊乱也可导致尿酸增高。近年来一些研究表明，尿酸含量变化揭示宫颈癌发展的过程，而血尿酸浓度与宫颈癌发展程度密切相关，是炎症类疾病的危险因素[18]。尿酸是谷氨酸转化组氨酸的中间体。尿酸下调可能与肿瘤组织或谷氨酸代谢紊乱的组氨酸代谢障碍有关[19]。Ogihara等[20]的研究表明，尿酸及其氧化产物可以作为体内自由基生成的标志。

甜菜碱可提供3个不稳定的甲基，是多种物质合成的原料，如肉碱、肌酸和嘌呤等；同时，通过去甲基作用生成甘氨酸，进入氨基酸代谢循环。由于甜菜碱可提供甲基和氨基酸，可参与机体氨基酸代谢、脂肪代谢及DNA 甲基化等过程[21]。尿液中甜菜碱的浓度较低时，可引发脂类代谢紊乱及相关炎症。甘露醇和氨基馬尿酸在尿液中的含量变化也是反映机体炎症的代谢标志物[22]。以上检测到的代谢产物可能是宫颈癌发病的独立危险因子。

1甲基鸟嘌呤、尿素和茶碱是嘌呤的衍生物。细胞外核苷酸可以通过不同亚型的P2受体调节癌细胞增殖、分化和凋亡，其中P2X7 受体导致细胞凋亡从而数量减少[23]。宫颈癌组织和正常组织相比，P2X7 受体水平较低，可能导致嘌呤代谢产物浓度变化[24]。

4结 论

将UHPLCQOrbitrap MS与PCA 等统计方法相结合，分别对11名宫颈癌患者与健康人的尿液进行快速分析。发现并鉴定出12种宫颈癌的潜在生物标志物，揭示了核酸代谢及氨基酸代谢在宫颈癌发病的变化，对于临床上宫颈癌的早期诊断、预防及治疗恶性肿瘤提供了重要参考。

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AbstractThis work aims to analyze and compare the potential biomarkers between cervical cancer （CC） patients and healthy controls （HC） The urine samples of 11 CC patients （age （4565 ± 56） years） and 11 HC patients （age （459 ± 32） years） were collected The metabolites of urine samples from CC and HC were analyzed by using ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole orbitrap tandem mass spectrometry （UHPLCQOrbitrap MS/MS）， which could provide evidence for early diagnose and disease pathway The LCMS data of urines were analyzed by principal components analysis （PCA） and orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLSDA） to identify the potential biomarkers Urine samples of CC patients were successfully discirminated from those of healthy controls A total of twelve significant metabolites were found and identified as potential biomarkers according to the established UHPLCQOrbitrap MS and MS/MS method Identification of biomarkers between CC and HC patients may play an important role in the study of mechanism of UC and its pathway

KeywordsCervical cancer； Ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole orbitrap tandem mass spectrometry； Metabonomics； Urine； Biomarkersendprint