镁钙合金浸提液对人结肠黏膜上皮细胞中基质金属蛋白酶9和基质金属蛋白酶抑制因子3表达的影响

王战会，孙高斌，孙宗斌，张兵兵，郑秋霞，刘少朋，段廷贺

(1.郑州大学附属洛阳中心医院普外科，河南 洛阳 471000；2.解放军150医院普外科，河南 洛阳 471003)

在可降解镁合金的研究中，生物材料和细胞的相互作用是一个需要重点考虑的问题。关于这方面的研究已有许多报道，如生物材料与细胞活性的关系、生物材料与细胞分化的关系等[1]。在细胞和镁合金相互作用的实验研究中所用的细胞有人骨髓间质细胞、鼠成纤维细胞L-929和MG63，而关于镁合金与肠上皮细胞相互作用的研究尚未见报道。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是一类降解细胞外基质的酶类，在肿瘤浸润转移过程中发挥着极其重要的作用[1]。MMP是一个大家族，因其需要钙、锌等金属离子作为辅助因子而得名。其中MMP9是MMP家族中较为重要的一类[2]。MMP抑制剂主要是内源性基质金属蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMP)，其中最主要的是TIMP3，其可结合MMP的活性位点，阻止胶原底物的进入[3]。人结肠黏膜上皮细胞NCM460被广泛用于研究肠上皮细胞行为的模型。镁合金在胃肠吻合中可用作吻合钉和外科缝合材料[4]。本研究选用镁钙合金来评价镁合金对人结肠黏膜上皮细胞MMP9及TIMP3的影响。

1 材料与方法

1.1细胞人结肠黏膜上皮细胞NCM460由解放军150医院中心实验室赠送，保存于-80 ℃低温冰箱，实验时给予复苏。

1.2主要试剂和仪器甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根过氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG购自美国Boster公司，兔抗-MMP9购自美国Santa Cruz公司，兔抗-TIMP3购自美国Bioss公司，SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒、Prime-Script®RT试剂盒、引物设计购自日本Takara公司，底物增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒、高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM) 购自上海碧云天生物科技有限公司，PTC-200 Peltier Thermal Cycler聚合酶链式反应(polyme-rase chainreaction，PCR)仪购自美国伯乐公司，CO2培养箱购自日本三洋公司，超净工作台购自苏州净化设备公司，LightCycler仪购自瑞士罗氏公司，KL05R离心机购自湖南凯达科学仪器有限公司，蛋白核酸测定仪购自德国Eppendorf 公司。

1.3镁钙合金浸提液的制备医疗级纯度镁钙合金由北京大学工学院提供，加工成直径11.3 mm、厚2.0 mm的圆片状，在碳化硅砂纸上磨平并抛光后，用无水乙醇超声清洗，环氧乙烷消毒后，根据ISO 10993制备镁钙合金浸提液[5]，按每1.25 cm2的镁钙合金表面积使用1 mL DMEM高糖培养基的比例将镁钙合金圆片浸没在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在37 ℃含体积分数5% CO2的培养箱中放置24 h，1 000 r·min-1离心10 min，用50 mL注射器吸取上清液，保存于4 ℃冰箱中备用，在3 d内进行相关实验。为了观测剂量-效应关系，实验时将上清液用DMEM高糖培养基稀释成体积分数100%、50%和10%的镁钙合金浸提液。

1.4实时荧光定量PCR检测NCM460细胞中MMP9和TIMP3mRNA的表达制备NCM460细胞悬液，将5×106L-1的细胞悬液加入24孔板中，每孔1 000 μL，分为空白对照组及加入不同浓度镁钙合金浸提液的实验1、2、3组，每组用1个24孔板，空白对照组每孔加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基2 000 μL，实验1、2、3组每孔分别加入体积分数10%、50%及100%的镁钙合金浸提液2 000 μL，每组设3个复孔，分别培养1、3、5 d，然后，TRIzol法提取总RNA，用蛋白核酸测定仪检测总RNA的浓度及吸光度(A260/A280)值。各基因引物序列由大连Takara生物有限公司设计与合成，MMP9上游引物为5′-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3′，下游引物为5′-CCTGTGTACACCCACACCTG-3′；TIMP3上游引物为5′-TTTTGTTTTGTTATTTTTTGTTTTTGGTTTT-3′，下游引物为5′-CCCCCCAAA-AACCCCACCTCA-3′；GAPDH上游引物为5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGT-3′，下游引物为5′-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3′。在PTC-200 Peltier Thermal Cycler PCR仪上运用反转录试剂盒反转录成cDNA，在LightCycler仪上运用SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR试验。PCR扩增条件为：第1个循环为95 ℃预变性30 s，接着行40个PCR循环：95 ℃变性5 s，62 ℃延伸20 s。随后在95 ℃和65 ℃之间进行融解曲线分析，结果分析采用2-△△CT(Livak法)。所有实验均重复3次。

1.5免疫印迹法检测NCM460细胞中MMP9和TIMP3蛋白表达制备NCM460细胞悬液，将5×106L-1的细胞悬液加入24孔板中，每孔1 000 μL，分为空白对照组及加入不同浓度镁钙合金浸提液的实验1、2、3组，每个实验组用1个24孔板，空白对照组每孔加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基2 000 μL，实验1、2、3组每孔分别加入体积分数10%、50%及100%的镁钙合金浸提液2 000 μL，每组设3个复孔，分别培养5 d，加入 2.5 g·L-1胰蛋白酶1 mL消化1～2 min，分别消化各组细胞，加蛋白裂解液，冰上裂解20 min，12 000 r·min-1离心5 min，收集上清液，测定蛋白浓度，蛋白上清液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，恒压转移至硝酸纤维素膜，用含50 g·L-1羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(tris buffered saline tween，TBST)封闭2 h，一抗于4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，然后与ECL底物孵育5 min，以GAPDH为内参照，在暗室中X线片显影，图像扫描。所有实验均重复3次。

2 结果

2.1各组NCM460细胞中MMP9mRNA表达比较结果见表1。培养1 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；培养3、5 d后，实验1组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平仍显著低于空白对照组，实验2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于空白对照组和实验1组，差异有统计学意义(P<0.05)；培养5 d后，实验3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平显著高于实验2组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养3、5 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后，差异有统计学意义(P<0.05)；培养5 d后，实验1组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平与培养 3 d 后比较差异无统计学意义(P>0.05)，实验2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于培养3 d后，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1各组NCM460细胞中MMP9mRNA表达水平

组别nMMP9mRNA培养1d培养3d培养5d空白对照组31.000±0.031 1.000±0.053 1.000±0.028 实验1组30.057±0.003a0.575±0.044ad0.680±0.031ad实验2组30.063±0.010a3.161±0.136abd10.612±0.427abde实验3组30.641±0.052abc4.514±0.179abd16.159±0.843abcde

注：与空白对照组比较aP<0.05；与实验1组比较bP<0.05；与实验2组比较cP<0.05；与1 d时比较dP<0.05；与3 d时比较eP<0.05。

2.2各组NCM460细胞中TIMP3mRNA表达水平比较结果见表2。培养1 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著低于空白对照组(P<0.05)，实验2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著高于实验1组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养3 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著低于空白组，实验2组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平显著低于实验1、3组，差异有统计学意义(P<0.05)。培养5 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。实验1组NCM460细胞中培养3、5 d后的TIMP3 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后，培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养3 d后，差异有统计学意义(P<0.05)。实验2组NCM460细胞中培养3 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著低于培养1 d后，培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养1、3 d后，差异均有统计学意义(P<0.05)。实验3组NCM460细胞中培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养1、3 d后，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2各组NCM460细胞中TIMP3mRNA表达水平

组别nTIMP3mRNA培养1d培养3d培养5d空白对照组31.000±0.025 1.000±0.049 1.000±0.003 实验1组30.265±0.048a0.502±0.040ad6.759±0.785ade实验2组30.471±0.009ab0.202±0.068abd5.147±0.885ade实验3组30.526±0.061ab0.454±0.031ac6.065±0.151ade

注：与空白对照组比较aP<0.05；与实验1组比较bP<0.05；与实验2组比较cP<0.05；与1 d时比较dP<0.05；与3 d时比较eP<0.05。

2.3培养5d后各组NCM460细胞中MMP9和TIMP3蛋白表达结果见表3及图1。培养5 d后，实验1组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；实验2、3组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平均显著高于空白对照组和实验1组，差异均有统计学意义(P<0.05)；实验3组NCM460细胞中MMP9蛋白表达水平与实验2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。培养5 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3蛋白表达水平均显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3蛋白表达水平两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表3培养5d后4组NCM460细胞中MMP9、TIMP3蛋白表达比较

组别nMMP9蛋白TIMP3蛋白空白对照组31.025±0.3711.062±0.105实验1组30.854±0.1342.665±0.064a实验2组32.719±0.235ab2.866±0.077a实验3组33.317±0.247ab3.367±0.116a

注：与空白对照组比较aP<0.05；与实验1组比较bP<0.05；与实验2组比较cP<0.05。

A：空白对照组；B：实验1组；C：实验2组；D：实验3组。

图1各组NCM460细胞中MMP9及TIMP3蛋白的表达

Fig.1ExpressionoftheMMP9andTIMP3proteininNCM460cellsineachgroup

3 讨论

与镁钙合金相比，目前临床上普遍采用的钛合金具有质量轻、弹性模量更加接近正常骨组织、避免应力遮挡等优点，同时具有无磁性、可加工性强等特点，是具有临床应用前景的一种新型金属材料。一种新的生物材料在进入临床之前必须进行生物相容性评价，完整的生物学评价包括初级急性毒性筛选、动物体内应用和临床试用3级试验，体外细胞实验是初级急性毒性筛选的一个重要方面。MMP是一种Zn2+和Ca2+依赖性的中性蛋白酶家族，其主要功能是降解和再塑造细胞外基质，维持细胞外基质的动态平衡，参与人体许多病理和生理过程[6]。目前已发现的MMP有20种以上，其中MMP9因其作用底物的广泛、表达细胞众多而备受重视，成为国内外研究的焦点之一[6]。MMP9又称明胶酶B，它是一种肝细胞合成的非特异性急性时相蛋白，在正常人体中含量极微，但在镁合金血管支架置入早期感染的急性炎症反应阶段，其含量在6 h内迅速增加，于24～48 h达到峰值，由于MMP9的半衰期<24 h，故在控制感染后其会快速降至正常。因此，MMP9可以作为评价镁合金血管支架置入早期炎症反应的一项指标[7]。体内MMP9所起的作用可被TIMP阻断[8]。TIMP由多基因家族成员组成，其能与MMP的催化区以11可逆性结合，抑制MMP的活性。TIMP主要由巨噬细胞和结缔组织细胞合成分泌，在体内分布广泛，目前报道的共有4种：TIMP-1、2、3和4，其中TIMP3是与细胞外基质结合的非可溶性蛋白，位于细胞外膜上[9]。MMP9和TIMP3的表达变化是测定生物材料的生物相容性时需要考虑的重要因素。本研究分析了与细胞应答密切相关的MMP9和TIMP3的表达，以更深入地了解可降解镁合金对肠上皮细胞的影响。NCM460细胞系作为一种有效的细胞模型被广泛应用于肠道植入材料生物相容性评价的体外实验。因此，本研究采用NCM460细胞为模型来评价镁合金作为肠道植入材料的可行性，所用的镁合金为镁钙合金，通过研究不同浓度镁钙合金浸提液对人结肠黏膜上皮细胞NCM460中的MMP9及TIMP3表达的影响，来研究镁钙合金的生物相容性。

本研究结果显示，培养1 d后，实验1、2、3组(体积分数10%、50%、100%浸提液组)NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著低于空白对照组，培养3、5 d后，实验1组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平仍显著低于空白对照组，实验2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于空白对照组和实验1组；培养5 d后，实验3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平显著高于实验2组。培养3、5 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后；培养5 d后，实验2、3组NCM460细胞中MMP9 mRNA表达水平均显均高于培养3 d后。本研究结果显示，随着浸提液浓度的增高，MMP9 mRNA表达水平具有增高趋势，且随着培养时间延长，MMP9 mRNA表达水平亦具有增高趋势，提示高浓度的镁钙合金浸提液容易导致早期炎症反应的发生。王汝朋等[10]研究结果发现，与正常对照组比较，镁合金血管支架植入后不同时间点冠状动脉局部MMP9阳性细胞数明显增多；与支架植入 24 h、3 d、5 d、1周比较，植入1个月后冠状动脉局部MMP9阳性细胞数明显减少，提示可吸收镁合金支架植入后的组织炎症程度轻，持续时间短。赵然尊等[11]研究结果发现，支架置入治疗组患者术前MMP9水平均高于对照组，且随访时再狭窄组患者MMP9水平与非再狭窄组患者比较均明显升高，提示二者可能参与血管成形后再狭窄的发生。王汝朋等[10]研究发现，MMP9峰值出现时间、持续时间可以评价镁合金支架置入后早期炎症反应的情况。上述研究与本研究结果基本一致，镁合金均能引起炎症反应，但在体内实验时，镁钙合金有一个逐渐降解的过程，因而，由其引起的早期炎症反应是比较轻微的。MMP9在高浓度镁钙合金浸提液培养过的细胞中高表达的机制仍不清楚，可能与浸提液中的钙离子浓度有关。MMP是一组Zn2+和Ca2+依赖的内肽酶，它们大小各异，底物不尽相同，但均含有信号肽、前肽、催化区和C末端4个结构域，催化区有2个Zn2+结合区和至少1个Ca2+结合区[12]。高浓度镁钙合金浸提液中的Ca2+可能会激活MMP9的高表达。

本研究结果显示，培养3 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著低于空白对照组，实验2组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著低于实验1、3组；培养5 d后，实验1、2、3组NCM460细胞中TIMP3 mRNA表达水平均显著高于空白对照组；实验1组NCM460细胞培养3、5 d后的TIMP3 mRNA表达水平均显著高于培养1 d后，培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养3 d后；实验2组NCM460细胞培养 3 d 后的TIMP3 mRNA表达水平显著低于培养1 d后，培养 5 d 后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养3 d后；实验3组NCM460细胞培养5 d后的TIMP3 mRNA表达水平显著高于培养1、3 d后。本研究结果提示，随着浸提液浓度的增高，TIMP3 mRNA表达水平具有增高趋势，且随着培养时间延长，TIMP3 mRNA表达水平亦具有增高趋势。导致TIMP3在高浓度镁钙合金浸提液处理过的细胞中高表达的机制仍不清楚，考虑可能与浸提液中的钙离子浓度有关，钙离子浓度增加导致MMP增加，从而进一步导致TIMP3的反应性增加。

综上所述，高浓度的镁钙合金浸提液对NCM460细胞中的MMP9及TIMP3基因表达有一定影响，容易导致早期炎症反应的发生，其机制可能与浸提液中的钙离子浓度有关。但在体内实验时，镁钙合金的降解是一个逐渐的过程，钙离子的释放会比较缓慢，由其引起的早期炎症反应是比较轻微的。

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