家蚕蛹致敏原蛋白的研究进展

唐 健 赵国栋 钱荷英 李 刚 周凯月 徐安英

(1江苏科技大学生物技术学院， 江苏镇江 212018； 2中国农业科学院蚕业研究所， 江苏镇江 212018)

家蚕是一种重要的经济昆虫，在我国从事栽桑养蚕的农民有1 000多万户[1]。家蚕蛹因含有极其丰富的营养物质，包含大量的人体必需氨基酸以及饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸，成为人们喜爱的食物之一，此外家蚕蛹还含有维生素、甲壳素、多糖类物质、微量的抗菌肽、溶菌酶、激素等生物活性物质，而且家蚕蛹中还含有大量的硒元素，可用于传统抗癌药物[2]。但是在食用家蚕蛹时有少数人会发生过敏反应，出现头晕、头痛等症状，究其原因主要是因为家蚕蛹中存在一些致敏原。为此，国内外学者开展了对家蚕蛹致敏原的相关研究。本文综述了家蚕致敏原的致敏方式、临床表现及对家蚕致敏成分进行了分析，并在叙述家蚕蛹致敏原检测技术的基础上，从30K家族蛋白等6类致敏蛋白总结了家蚕蛹致敏原分子生物学的研究进展，以期为家蚕过敏性疾病的研究和特色食用蚕品种的培育开发提供理论参考。

1 致敏原研究概况

正常情况下，人体会通过产生抗体来防御外源有害物质的侵入，食物过敏是机体把无害物质误认为有害物质而产生抗体的一种病症，这种引起人体发生食物过敏的物质就是致敏原[3]。致敏原也叫过敏原或者变应原，绝大多数的致敏原是蛋白质，它是指能够选择性刺激机体内的免疫物质，从而诱导其产生特异性的免疫球蛋白，介导I型过敏反应[3]。一般致敏原是具有酸性等电点的蛋白质，因其要穿过人体的粘膜表面，所以具有较小的分子量和水溶性[3]。

在过去的几十年内，各国的科研工作者陆续发现了上千种致敏原，包括植物源性致敏原和动物源性致敏原，从现有的文献资料来看，大部分植物源性致敏原不是分散在各个蛋白质家族中，而是仅存在于27个蛋白质家族中，而且主要分布在醇溶蛋白超家族、Cupin超家族、Bet v 1家族和Profilins家族；而动物源性致敏原主要集中于原肌球蛋白家族、钙离子结合蛋白家族和酪蛋白家族，由此说明蛋白质的结构对其功能以及生物活性有着至关重要的作用[4]。

2 家蚕致敏原的致敏方式及致敏成分的分析

2.1 家蚕致敏原的致敏方式

目前，引起人们发生家蚕过敏的方式大致分为吸入性过敏、接触性过敏和食入性过敏3类[2]。吸入性过敏：由于家蚕的广泛养殖，蚕丝制品的普遍使用，使得在加工过程中，偶有丝尘颗粒漂浮于空气中而被人体吸收，引发一系列过敏反应[5]；另外，在雌雄蛾交配时产生的鳞毛悬浮于空气中，也可被人体吸入，引发过敏反应[6]。接触性过敏：家蚕过敏的患者接触到蚕丝制品时，可能会导致过敏；另外，在医学上丝质缝合线也有引起患者过敏的案例发生[7-8]。食入性过敏：在我国广大养蚕地区一直有食用蚕蛹的习惯，少数人也会出现食用蚕蛹导致过敏的现象[9]。

2.2 家蚕致敏的临床表现

当大量的鳞毛被人体吸入后，大部分的人会出现咳嗽反应，如此反复甚至发展成哮喘。在日本，引起过敏性鼻炎的重要因素之一就是吸入蚕蛾的鳞毛[10]。家蚕蛹在传统中医中可作为一种药物而被用来治疗高血压和脂肪肝，但是食用蚕蛹过敏的患者常会出现头晕、头痛、恶心、呕吐等症状[11]。在蚕种场或者缫丝厂，也有对蚕丝过敏的患者出现，并且有调查研究显示，儿童哮喘的发病率与该地区的丝制品使用率存在正相关性[12]。

2.3 家蚕致敏原的致敏成分

2.3.1 幼虫致敏原成分分析 2007年，深圳大学研究人员发现家蚕的1～4龄幼虫中均含有82 kD和79 kD的特异性致敏原，并且在每个时期都有微量的其他致敏原出现，但在5龄蚕体内却产生了新的特异性致敏原为30 kD的蛋白质，提示家蚕在不同时期的致敏原成分会发生变化[13]。

2.3.2 蚕蛹致敏原成分分析 家蚕蛹是由家蚕幼虫发育转化而来的，由于其营养价值高，含有丰富的蛋白质和氨基酸以及其具有的药用价值，所以我国有很大一部分人食用蚕蛹，但其中有极少数人食用蚕蛹会发生蚕蛹过敏反应。针对极少数人食用蚕蛹会发生过敏这一现象，深圳大学变态反应疾病研究实验室开展了家蚕蛹致敏原的研究，通过对家蚕蛹蛋白的分离，发现了27～138 kD的蛋白质组分，并运用免疫印迹学技术鉴定到了其主要致敏原为82 kD、79 kD、30 kD的蛋白质，其中30K蛋白是家蚕蛹的主要致敏原[14]。

2.3.3 蚕丝致敏原成分分析 蚕丝是家蚕最主要的致敏原，由丝胶和其包裹着的三角形或者椭圆形的丝素组成，其中丝胶占30%、丝素占70%；丝胶是蚕丝致敏原的主要成分，它能够诱导免疫球蛋白作用机制的发生[15]。在加工蚕丝过程中，优良的蚕丝被制作成丝绸，品质差一点的蚕丝被用作填充物制作成相关的丝织品。在丝绸制作过程中，会用热碱水反复洗涤，使丝胶蛋白去除，所以生活中的丝绸一般不会引起过敏反应[16]。随着电泳技术的发展，对蚕丝蛋白的分离有了越来越清楚的研究， DEWAIR等[17]最早将蚕丝蛋白分离为分子量在14～70 kD之间的12种多聚肽，并且检测到与过敏患者的血清有高度结合的IgE(人体的一种抗体)。而ZAOMING等[18]分离出13种蛋白条带，并且发现出现致敏原成分的蛋白集中在35～50 kD之间。近年北京协和医院证实了13条多聚肽，分布于97.2 kD以下，主要的条带在21.9 kD以下，然后通过Western blotting验证出识别过敏患者血清的蛋白带主要在35.1～50.0 kD之间和21.9 kD以下[19]。

3 家蚕蛹致敏原的检测技术和分子生物学研究

3.1 家蚕蛹致敏原的检测技术

目前实验室中家蚕蛹致敏原的检测技术一般分为基于核酸的检测技术和基于蛋白的检测技术。

3.1.1 基于核酸的检测技术 主要是利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，经过变性、退火、延伸等几步反应循环进行，体外扩增出目的致敏原基因片段，再通过检测编码致敏原基因是否存在，从而说明致敏原存在的可能性，这种方法稳定、高效、实用，因为DNA比蛋白质稳定得多，耐热性也相对较好，而且蛋白质在提取的过程中很容易失活，尤其当蛋白质含量较低时[20]。近年来PCR的使用得到普遍的推广，并已成熟发展为一种标准化的检测方法，只要有微量的目的基因就可以被扩增出来从而被检测到，这大大弥补了蛋白检测技术的缺陷[21]。YANO等[22]运用PCR方法对加工过的胡桃进行了残留致敏原的检测，为PCR检测技术开启了一个良好的开端。刘硕等[23]成功地利用PCR技术克隆表达出家蚕蛹致敏原几丁质酶基因，为PCR技术在蚕蛹致敏原检测中的应用提供了实验基础。

实时荧光定量PCR(RT-PCR)是在PCR反应体系中加入荧光基团进行PCR实时检测，该方法可以快速准确地检测到致敏原基因的表达情况，从而可以判断出食品中致敏原基因的含量[24]。董薇等[25]首次采用RT-PCR技术对芝麻中致敏成分进行检测，结果表明RT-PCR对芝麻致敏原基因十分灵敏，灵敏度可达到1 mg/kg，符合痕量检测的要求，这为RT-PCR技术应用于蚕蛹致敏原检测提供了实现的可能。

3.1.2 基于蛋白的检测技术 从检测方法上来说，此项技术是依据色谱学、质谱学、免疫学方法建立的，而免疫学方法主要又有酶联免疫法、酶标记过敏原吸附法、放射过敏原吸附法、火箭免疫电泳法等，其中酶联免疫法是目前检测食物过敏原最主要的方法，其原理是通过酶标记的抗体与靶向抗原或蛋白结合，同时伴随着颜色反应，然后通过测定颜色反应的有无或颜色的深浅程度来进行定性定量分析，该方法准确、高效、灵敏、操作方便[26]。

3.2 家蚕蛹致敏原分子生物学研究

目前发现的家蚕蛹致敏原蛋白大致有6类，包括30K家族蛋白、几丁质酶、热休克蛋白20.8、卵黄原蛋白、家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂和丙糖磷酸盐异构酶[27]。

3.2.1 30K家族蛋白 30K蛋白是家蚕特有的一类低分子量的脂蛋白，它由脂肪体合成，然后分泌到血液当中，成为家蚕生长发育过程中重要的贮藏蛋白之一。30K蛋白的功能复杂多样，除了为家蚕蛹期和卵的发育提供营养物质来源以外，还可能参与到免疫和细胞凋亡等重要的生物学过程。2007年，刘志刚等[13]从不同时期家蚕的提取液中分离出20条左右的蛋白条带，并且成功地分离纯化出5龄蚕新出现的30 kD的特异性致敏原，并通过MALDI-TOF-MS鉴定出其为外膜蛋白，可能是5龄蚕发育过程中家蚕体壁出现的新蛋白组分，并且转移到家蚕蛹中。2017年，曹会等[28]成功克隆出家蚕蛹30K脂蛋白家族成员Bmlp7的融合蛋白，并发现其是一种潜在的致敏原，这为30K脂蛋白的研究做出了重大的贡献。

3.2.2 几丁质酶 几丁质酶是催化几丁质水解生成N-乙酰葡萄糖胺反应的酶，它可以消化吸收老化的角质层。刘硕等[23]成功克隆家蚕蛹主要过敏原几丁质酶基因并构建了原核表达载体，分析出该基因含有长度为1 668 bp的开放阅读框，编码555个氨基酸；该蛋白质的相对分子质量为61 500，等电点为5.78，编码序列与数据库中已知的家蚕蛹几丁质酶基因的同源性为99%，为家蚕蛹过敏原几丁质酶的重组表达和免疫活性鉴定等奠定了基础。2016年，赵祥杰等[29]通过生物学信息软件的分析，对蚕蛹糖水解酶18家族几丁质酶的同源性、二级结构、亲疏水性、可塑性、表面可及性和抗原性等进行了综合分析，确定其抗原表位位点，为深入开展该致敏原的免疫学特性研究打下了基础，并为家蚕蛹蛋白的脱敏研究提供了理论基础。

3.2.3 热休克蛋白20.8 热休克蛋白(heat shock proteins，HSP)是动植物在受到高温、高压、饥饿或者细菌感染等不利因素的刺激下，应激产生的一种遗传上高度保守的特异性蛋白，它会帮助机体在非正常情况下恢复功能[30]。它的种类繁多，一般按照分子量分为90 家族(分子量约 83～90 kD)、70 家族(分子量约 66～78 kD)、60 家族(分子量约 60 kD)和小分子量家族(分子量约 15～39 kD)等4个家族[31]。家蚕蛹热休克蛋白20.8(BmHSP20.8)属于小分子量家族，可以作为分子伴侣，在蛋白质的变性与复性中发挥重要作用，同时它也被证明在细胞增殖、细胞分化中发挥重要作用[32]。刘硕[27]为了更清楚地了解热休克蛋白，从家蚕蛹中成功克隆表达出BmHSP20.8，并证实了其致敏原性。2014年，王婵[33]通过研究发现BmHSP20.8只存在于线粒体中，并发现BmHSP20.8的线粒体定位信号区域由该蛋白基因开放阅读框的427～561 bp区域编码，位于该蛋白C端的143氨基酸至186氨基酸区域，还通过实验证实了BmHSP20.8具有分子伴侣活性，这一结果为研究家蚕小热休克蛋白功能奠定了基础。2009年，张静[34]筛选家蚕蛹期cDNA文库，发现1条已知的家蚕小热休克蛋白的基因BmHSP21.4，将其成功克隆表达，并通过荧光定量PCR和Western blotting免疫印迹分析，推测其与家蚕的变态发育无关。

3.2.4 卵黄原蛋白 卵黄原蛋白(vitellogenin Vg)是卵黄磷蛋白的前体，是卵形成和胚胎发育的重要营养物质，主要在卵生动物的雌性脂肪体中合成，通过受体介导的胞吞作用进入卵巢，以卵黄颗粒的形式被储存和利用[35]。2014年，罗娟等[36]以家蚕基因组数据库为基础，分析了基因在家蚕染色体上的位置，预测了蛋白的结构以及进化的趋势等，并发现家蚕卵黄原蛋白(BmVg)在雌性家蚕脂肪体中大量表达，并且持续到整个蛹期。卵黄原蛋白在白鲸鱼子酱[37]和鲑鱼卵[38]中被鉴定为致敏原。

3.2.5 家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂 家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂是家蚕血液中重要的蛋白酶抑制剂，主要存在于脂肪体、生殖腺和血液等部位，包括多个成员，具有丰富的多态性[39]。2006年，李娟等[40]发现了家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂在群体水平上的多态性分布，家蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂广泛存在于不同家蚕品系中，同时其多态性的分布特征也表明其生理功能在进化过程中发生了明显的分化。2013年，赵萍等[41]对胰凝乳蛋白酶抑制剂在蓖麻蚕主要组织中的分布及血液中的含量和活性做了探究，与家蚕血液中的含量相比，蓖麻蚕血液中的胰凝乳蛋白酶抑制剂含量更高，胰凝乳蛋白酶抑制剂种类多态性分布不仅体现在不同品系的同一组织，还体现在同一品系的不同组织。

3.2.6 丙糖磷酸盐异构酶 针对丙糖磷酸盐异构酶致敏原的深入研究较少，我们还需要进一步地探索。

除此之外，2016年WANG等[42]运用分子生物学和蛋白组学的方法从家蚕蛹中发现6种潜在的致敏原，分别为热休克蛋白20.4、表皮蛋白类30前体(CPH30)、表皮蛋白RR-2基序63(CPR63)、硫醇过氧化还原酶、LOC101743840，并且利用免疫学技术验证了硫醇过氧化还原酶的致敏原性。之后多位学者相继验证出其余5种致敏原的致敏原性。2016年，MA等[43]成功地克隆表达出化学感受蛋白5前体CSP5基因，鉴定其免疫学特性，采用生物信息学方法预测CSP5蛋白的理化性质、三级结构、潜在B细胞抗原表位。梁志林等[44]成功克隆出家蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63(CPR63)基因，并且通过免疫学分析发现其能够与蚕蛹过敏患者血清IgE结合，证实了重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性，用Prot Param Tools预测出其稳定的理化性质；用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其二级结构及三级结构主要是以无规则卷曲组成。HU等[45]鉴定出家蚕蛹CPH30蛋白，之后合成该基因，运用分子生物学技术，成功克隆表达出CPH30蛋白，证实其免疫原性，并预测出其氨基酸序列的第57～69位和第150～158位为潜在的B细胞表位。2017年，梁志林等[46]克隆表达了LOC101743840基因，验证了其致敏原性，并且预测出蛋白的理化性质、蛋白结构、抗原表位，这些都为进一步研究家蚕蛹的致敏原成分奠定了理论基础。

4 结语

家蚕蛹蛋白是一种极富营养价值和经济价值的自然资源，可作为开发食品、医药用品等的优质原料，同时也是一种人体所需的优质动物蛋白来源，但是由于其可能导致的致敏问题，近年来在学术上引起了广泛的关注，随着分子生物学和蛋白质组学的发展，有关家蚕蛹的致敏原研究将会不断深入，期望早日制备出高质量的标准致敏原从而应用于蚕蛹过敏性疾病的诊断和治疗，同时从家蚕种质资源的源头出发，筛选出无致敏原和少致敏原的家蚕种质资源，为特色的食用家蚕品种的研发、选育和推广提供基础。