猪繁殖与呼吸综合征及其免疫防控研究进展

桂红 （湖南省永州市祁阳县畜牧水产局 426100）

猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）自20世纪80年代在美国爆发以来，给全球养猪业带来巨大的经济损失。PRRS由猪繁殖与呼吸综合征病毒 （PRRSV）引起，2006年我国爆发的 “无名高热病”猪病疫情，经诊断为由变异的PRRSV导致，称为高致病性猪繁殖与呼吸综合征 （Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， HP-PRRS）。 与 PRRS 相比，HP-PRRS具有更高的发病率及致死率[1]。感染PRRSV的发病猪表现出四肢和耳部皮肤发绀，故PRRS又称 “蓝耳病”。PRRS能引起妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障碍，仔猪则出现呼吸道疾病[2]。PRRS传播快、传染性强，PRRSV感染猪表现出发热、厌食、呼吸困难，并造成继发性感染导致猪只死淘率增加，PRRS的频繁爆发给全球养猪业造成巨大的经济损失[3]。目前PRRSV/HP-PRRS在我国爆发性流行态势已得到有效控制，近几年趋于零散式发展，但在我国各省区依然存在[4]。此外，由于PRRSV具有广泛变异性和毒株多样性，对于该病的免疫防控及完全控制依然存在巨大挑战。

1 病原学

1.1 PRRSV的生物学特性

PRRSV属尼多病毒目 （Nidovirales），动脉炎科病毒属（Artevrriidae）[5]，为单股正链RNA病毒。PRRSV有囊膜，直径为45～65nm，病毒粒子呈球形或卵圆形，核衣壳直径为23～35nm，呈二十面体对称，其表面有纤突[6]。PRRSV的RNA大约含15000个碱基，含9个开放阅读框 （Open Reading Frames， ORFs）： ORF1a/1b， ORF2a/2b， ORFs3～7[7]， 每个ORF与相邻的ORF均发生部分重叠。其中ORF1a/1b编码RNA复制酶，与PRRSV的复制相关，ORF1a编码的寡聚蛋白经加工后形成NSP1α、NSP1β、NSP2～5这6种非结构蛋白。ORF2～ORF5分别编码囊蛋白GP2a/2b、GP3、GP4和GP5[8]，其中GP3是突变性最高的蛋白之一，有一定的抗免疫作用，GP4为RRSV主要结构蛋白，与免疫导向性相关，GP5则与机体产生特异性抗体有关[9]。ORF6编码膜基质蛋白 （M蛋白），其分子量为18～19kD，M蛋白能刺激T淋巴细胞增生，诱导细胞免疫；ORF7编码核衣壳蛋白 （N）[10]。

根据基因序列和抗原特性上的不同，PRRSV可划分为欧洲型 （Ⅰ型）和美洲型 （Ⅱ型）两个血清型，两种毒株间仅有大约80%的氨基酸同源性，美洲型为我国主要流行的毒株，但在一些地区也分离到欧洲型毒株[11]。Ⅰ型和Ⅱ型的NSP2蛋白存在很大差异，其氨基酸序列仅有32%的同源性，而变异株HP-PRRSV也是由于PRRSV的NSP2缺失30个氨基酸导致的[12]。ORF5编码的GP5为PRRSV最容易发生变异的结构蛋白，同时也最具有抗原性。疫苗毒在猪体内增殖过程中，PRRSV基因组选择性地向强毒株发生突变，且随着病毒复制时间的延长，其遗传变异性及抗原变异性均呈现出不断增加的趋势，其中ORF5的突变速率最高，其选择性突变能力也最强。有研究显示，这一特性有利于PRRSV的免疫逃避[13]。

1.2 PRRSV致病机理

PRRSV对猪肺泡巨噬细胞 （PorcineAlveolar Macrophages，PAM）具有亲嗜性，主要感染猪体内的PAM。在感染过程中，PRRSV首先与PAM表面的硫酸乙酰肝素（Heparin Sulphate，HS）接触，随后转换成与唾液酸黏附素（Sialocadhesin，Sn）发生更稳定的互作，形成病毒-受体复合体[14]。复合体在网格蛋白的介导下发生內吞，随后进入早期包涵体中，在包涵体和PAM表面的CD163（Cluster of Differentiation 163）的作用下，病毒基因组随之被释放至细胞质中[14]。PAM被破坏后释放的超氧化物阴离子使黏膜纤毛系统受损，导致肺泡屏障作用的下降甚至丧失，病原菌侵入肺内导致继发性感染[15]。

在感染PRRSV早期，PRRSV的GP5蛋白免疫显性表位诱导机体产生非中和抗体免疫反应，以减弱或屏蔽下游的中和表位，进而导致机体不能产生相应的免疫应答[16]。研究表明，PRRSV逃避及延迟中和抗体过程主要由GP5蛋白的第51位氨基酸和GP3的131位氨基酸N端糖基化介导产生[17]。

PRRSV具有抗体依赖性增强 （Antibody-dependent enhancement，ADE)的生物学特性，ADE的作用使PRRSV更易于侵入靶细胞[18]。有研究显示，与单独注射PRRSV相比，猪注射PRRSV和PRRSV抗体后，病毒在胎猪体内的复制显著增强，而在体外培养的PAM中加入PRRSV抗体后，PRRSV数量也显著增加[19]。由于PRRSV的ADE作用，当母源抗体水平降至保护水平以下时，通过母原抗体获得PRRSV被动免疫的仔猪患病风险随之增加，这也为PRRS防疫带来困难。此外，PRRSV感染后可引起仔猪淋巴细胞增生，使其发生免疫损伤，并诱导外周血单核细胞和肺泡巨噬细胞等凋亡[20]。PRRSV还可通过诱导调节T细胞分化及T细胞免疫[21]、影响细胞因子的释放[15]、抑制树突状细胞功能[22]等多种途径抑制机体天然和适应性免疫应答。

2 PRRS的诊断

PRRSV传染性强，主要经过呼吸道等的水平传播及胎盘的垂直传播，对不同生长阶段及品种的猪均具有感染力。病猪、带毒猪、病母猪所产的仔猪均具有传染性，病猪分泌物、精液、排泄物污染的饲料和水、死胎、胎衣等都可成为传播媒介，且感染猪临床症状消失后相当一段时间内仍能排毒[23]。与PRRSV相比，HP-PRRSV感染猪发病率更高、发病急、传播快、病程长，且病死率极高。HP-PRRSV在妊娠母猪和1月龄以内的仔猪最易感，肥育猪也会发病，40日龄以内的仔猪病死率高达100%，育肥猪病死率达50%[24]。

猪感染PRRSV的5d左右即出现明显临床症状。症状包括体持续高热 （体温达41℃以上）、精神沉郁、食欲低下，发病早期皮肤发红，而随病程发展，病猪出现咳嗽、气喘等呼吸道症状，四肢、耳部出现蓝紫色。妊娠母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎和弱仔，仔猪断奶前死亡率增加[25]。病猪剖检可见胸腔积液，全身组织器官均有不同程度的淤血、肿胀，皮下弥漫性出血，肺充血严重，肺间质浸润增宽，肺泡浸润、出血。镜检可见肺组织有明显出血现象，肺泡面积缩小，血管壁变薄，毛细血管内皮肿胀[26]。

除临床诊断，逆转录PCR（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR）、酶联免疫吸附剂测定 （Enzyme Linked Immunosorbent assay，ELISA）、免疫过氧化物酶细胞单层试验 （IPMA）、 间接免疫荧光试验 （Indirect Immunoinfluscent Assay，IFA）、原位杂交 （In Situ Hybridization，ISH）、基因芯片等实验室诊断技术[27]为准确、快速确诊PRRS，防止病情蔓延、减少损伤提供有效方法。其中ELISA由于样品检测时间短，且操作过程方便易行，具有高特异性和敏感性，常用于大规模的检测[28]。RT-PCR技术是近年来快速发展的一种有效的分子生物学诊断技术，检测快速、准确，在PRRSV感染初期具有高灵敏度，而新建立的多重PCR、RTPCR-RFLP等技术不仅可检测各种临床样品，还可鉴别不同基因型的毒株，区分疫苗株和野毒株[29]，在PRRSV检测中广泛应用。

3 PRRS的疫苗防控

3.1 灭活苗与弱毒苗

疫苗免疫是控制PRRS流行经济比较有效的措施。PRRS疫苗最早于1993年在欧洲开始使用之后北美也开始使用疫苗预防该病。临床上主要使用灭活苗和弱毒苗来防控PRRS，其中灭活苗生产工艺相对简单，能有效避免散布病毒和造成新疫源的危险，具有安全、便于贮存及运输的优点[30]。接种灭活苗的PRRSV感染猪的中和抗体滴度和抗干扰素IFN-γ分泌明显提高[31]。但灭活苗产生的免疫主要为体液免疫，诱导细胞免疫的能力低，导致免疫效果不理想，不能有效清除感染猪体内的病毒，常导致免疫失败[32]。此外，灭活苗的还有免疫剂量大、需多次接种等缺点。

通过不同的手段，使PRRSV毒力减弱或消失产生弱毒苗，接种后可刺激机体免疫系统产生针对PRRSV的免疫反应。与灭活苗相比，弱毒苗具有产生抗体快、持续时间长、保护力强等优点，并且在改善临床症状的效果比灭活苗好，但弱毒苗存在散毒和毒力返强的潜在危险[33]。研究表明，从胎儿、死胎及死亡仔猪中分离的疫苗源毒能感染妊娠母猪，接种PRRS弱毒苗导致母猪繁殖性能下降，甚至能通过子宫感染胎猪[34]。

3.2 新型疫苗

随着分子生物学技术进步，新型PRRSV疫苗得到快速发展，一系列新型疫苗开始出现，并在实验室阶段展示良好的应用前景。基因工程疫苗是新型疫苗的研究重点，包括活载体疫苗、核酸疫苗、重组疫苗等。活病毒载体疫苗是将PRRSV的免疫相关基因整合进另一种载体基因组，动物被接种后，PRRSV免疫原基因可随载体复制而表达，从而使机体产生免疫应答并获得对PRRSV的抵抗力。与机体产生特异性抗体有关的GP5通常作为整合基因，如表达PRRSV GP5蛋白的重组牛痘病毒、传染性胃肠炎病毒、重组伪狂犬病毒的活载体疫苗，此外还有表达GP5和GP3的重组禽痘病毒活载体等[35]。核酸疫苗则通过把外源基因插入真核质粒载体上构成重组质粒，重组质粒注射到动物体内后，外源基因随着宿主细胞的转录合成抗原蛋白，从而激活机体免疫系统[36]。Zhang H B[37]等制备VPIL4/IL6-CNP为一种新型PRRS疫苗，该疫苗融合了猪白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素（IL-6），可提高仔猪免疫功能。

除上述几种疫苗，亚单位疫苗、基因缺失疫苗也是近年来研究较多的新型疫苗。与传统的疫苗相比，这些新型疫苗可显著提高机体体液免疫和细胞免疫应答。不过这些疫苗的研制依然还处于实验室试验阶段，要真正应用于临床大规模免疫，仍需要很长的时间。

4 结语

PRRSV基因组及抗原性的高度易变异性，以及该病毒所具有的逃避机体免疫监视能力，防疫及完全控制PRRS依然任重道远。此外，PRRSV还可抑制机体免疫应答，使其他病原的易感性增强，临床上通常表现为猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病 （PCV）、猪瘟 （SFV）等疫病的综合症状，这给PRRS的诊断及治疗造成极大干扰。PRRSV易变异性等生物学特征给猪群有效免疫带来挑战，但疫苗免疫依然是控制PRRS流行的重要途径，研发确实、高效、可靠的新一代疫苗是控制PRRS的重要途径。此外，猪场免疫程序中应充分考虑PRRSV疫苗与CSF、口蹄疫 （FMD）、PCV等疫苗之间的干扰现象，避免影响免疫效果。在加强对PRRSV的病毒流行学及病毒作用机制等的研究、加快疫苗研制的同时，必须加强饲养管理、生物安全及环境控制，提升猪群免疫力，发病后采取抗病毒与中药治疗结合的方式，防止继发感染，及时进行病畜淘汰及尸体无害化处理等措施，防止PSSR的扩散流行。

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