疫苗及其在水生动物疾病预防中的应用（六）

文/王玉堂

上接2018年11期

七、发展我国水产疫苗的几点建议

（一）加大科技投入，建立高效研究体系

我国疫苗研究基础薄弱，疫苗产品的研制多处于实验室阶段，加速其向实用化和产业化方向发展急需科技投入的推进。可将投入重点放在水产品重大传染病中尚缺和急需的水产疫苗制剂，开展水产动物免疫学基础、水产动物免疫制品制造、水产动物免疫技术应用等研究，并将疫苗工厂化生产的良好生产管理规范（GMP）、中试基地等相关的研究条件建设列入重要的保障投入范围。在人才队伍、研究设备、研究方法、实验材料等方面实现全国范围内的交流、共享、流动与协作，建立科学、先进、高效、合理运作的水产免疫科学技术研究体系。

（二）加强政策引导，促进疫苗应用

政府已在水产食品安全、水环境安全方面制定了相关的条例并开展了监督管理。近年来，农业农村部积极采取“渔用药物使用准则”等系列水产养殖无公害规定、渔药禁用清单、取消省级兽药生产许可证发放资格而集中由农业农村部统一受理、检疫制度、渔药处方制度等相关行动计划的实施与完善，使渔药规范逐步建立起来，毒性大的药物将被淘汰，更可喜的是从管理者、研究者和从业者在“两安全”的认识上有了质的飞跃。在此背景下，对疫苗部分替代化学药品的引入正合时宜，可在政策和法规上加以引导，如可在保证水产良种的内涵中加入疫苗防疫的内容，并逐步实现苗种免疫制度化等等的做法。

（三）加强技术培训，提高从业者素质

对于疾病，尽管人们都接受“以防为主”的观念，但我国的水产养殖仍处于发病才急用药的状况。其主要原因除了客观上预防性渔需品的缺乏，还有从业人员对“防”的科学认识不足，存在没有病不增加前期成本的侥幸心理或表现出无从下手。要改变现有局面，需要提高从业者健康养殖技术水平，增强保护养殖环境和提高水产品安全质量的意识，从科学普及的角度使水产疫苗的优越性逐渐被养殖者所了解。要发挥研究机构、高校和技术推广部门的技术培训、技术咨询和技术服务的人才资源和职能作用，共同促进从业者素质的提高和推进产业的发展。

总之，我国水产疫苗是个方兴未艾的产业，相关技术研究应紧跟国际前沿，结合我国现阶段的基础，面向水产养殖生产实际，以自主研究为主，从多方面促进产业化技术研究，为我国的水产养殖的可持续发展提供技术支撑，有效提升产业国际竞争优势，加速传统水产养殖产业的调整。

八、鱼类疫苗学的研究概况

免疫预防是通过刺激鱼类的免疫系统产生非特异性免疫来增强鱼体抗病能力，从而降低疾病发生率，并减少损失。鱼类免疫学是一门年轻学科，但在科技研究、实际生产应用方面已取得了一些重大突破，解决了一些养殖生产上急需的问题，并取得了较好的经济和社会效益。

（一）疫苗的接种方法

鱼类疫苗的接种方法主要有三种：其一是腹腔或肌肉注射；其二是浸泡或喷雾；其三是口服。这三种方法在预防保护的实用性和成本与效益方面均有各自的优点，如注射免疫能有效利用抗原，获得较强的免疫效果，若辅以佐剂更是可增强效果（Paterson and Fryer，1974；Cossapici-Dunier，1986；杨先乐等，1993），但这种方法易使鱼类受伤，费时费力，且小鱼不易操作。浸泡免疫省时省力，方便操作，大小鱼均适宜操作，但疫苗进入机体的机理不清（陈秀男等，1987），疫苗的吸收效果受到多种因素的制约，不易掌握。口服疫苗对鱼类无损伤，操作简单，不受时间、地点和鱼体大小的限制，但疫苗的消耗量大，免疫效果不稳定。目前口服疫苗主要存在抗原的吸收和表达效果问题（Quentei and Vigneulle，1997；Moore et al，1998）。目前的研究工作主要集中在抗原进入鱼体胃部和前肠时如何才能不被消化和分解，顺利达到后肠刺激其中具有免疫力的组织产生抗体。采用海藻胶型的抗原取得了良好进展（Joosten et al，1997）。

（二）疫苗的种类

1.根据获得疫苗的方式分类

（1）灭活疫苗

它是将病原体的感染性蛋白用某种方法灭活后获得的。用于水产养殖的疫苗多数为灭活疫苗，如弧菌疫苗（Vibrio anguillarun和Vo.ordalis）。Hitra病毒苗（V.Salmonicida）和红嘴病菌苗（Yersinia ruckeri）等革兰氏阴性菌的带病原的菌苗已可以通过液体发酵和福尔马林灭活进行生产。这些疫苗可以通过注射或浸泡的方法使用。若用于疫苗制备的血清型涵盖了所有菌株，并且疫苗使用方法正确，这类疫苗是很有效的（Stevenson，1997；Toranzo et al，1997）。近年来，用于抗大麻哈鱼传染性胰腺坏死病的IPNV疫苗、抗鲑鱼传染性造血器官坏死症的IHNV疫苗和抗草鱼出血症感染的GCRV疫苗等灭活疫苗已得到成功应用（Dixon，p，1997）。

（2）活疫苗

目前鱼用活疫苗有三种类型。减毒疫苗包括VHSV的F25（21）抗热株苗、CCV减毒疫苗、疖疮减毒疫苗、IHNV减毒疫苗和草鱼出血症细菌培养的弱毒疫苗（许淑英等，1994）。Benmansour等（1997）的研究结果表明，活的减毒疫苗应用于水产养殖业有许多优势。活疫苗（减毒疫苗）易于接种，如果疫苗株被接种的鱼排出体外，那么在整个养殖期内，抗原就会在鱼群内进行有效扩散，获得较好的免疫预防效果。另外，活疫苗的生产成本较低，即投放周期短、免疫剂量低、免疫持续时间长等。其不足之处主要是活疫苗在自然条件下安全性差，可能会导致病毒的转变，在生态环境中失去控制。异种疫苗是利用与病原体交叉反应的异种病原体制成的疫苗。安全性好，免疫期长，但不易获得。如小瓜虫病的梨形四膜虫疫苗（Rukyani and Taukhid，1990）。用有致病力的病原菌制成的疫苗，如草鱼出血病低温隐性感染疫苗已在生产上成功应用，获得较好免疫效果（康惠等，1989）。

（3）基因工程重组疫苗

近几年来，已开始利用DNA重组技术来生产保护性抗原，这种产品生产成本较低，质量优良，应用效果较好。在水产养殖方面，基因工程重组疫苗的研究主要集中在病毒疫苗上。研究人员发现一种存在于能引起虹鳟病毒性出血病（VHS）和鲑鱼传染性造血器官坏死病（HIN）的病毒上的糖蛋白具有抗原性基因，其中性抗体在实验条件下已经能诱导虹鳟产生中等水平的免疫能力（Lorenzen et al，1993），这类糖蛋白在大肠杆菌中已获得表达（Noonan et al，1995）。目前VP2肽序列在大肠杆菌中表达可以生产者rVP2肽段，这一肽段能诱导产生IPNV特异性抗体（Christie，1997）。基因工程疫苗使用方便，生产成本低，易规模化生产，且使用安全；因为DNA序列编码是单一的一段病毒基因，逆转的可能性极小。但因其研制周期长，免疫原单一，病原体稍有变异就会失去保护作用。

2.根据抗病原的类别分类

（1）细菌疫苗

从弧菌（Vibrio anguillarun和V.ordalis）和H itra病菌（V.Salmonicida）中获得的抗原已在水产养殖业上应用（Toranzo et al，1997），这些病原微生物引起的疾病表现为典型的败血症。V.vulnificus和V.viscosus使鱼类免疫学家面临新的课题。前者是机会性人体病原菌，后者则会引起大西洋鲑鱼 “冬季溃疡”，严重影响鱼的商业价值。已有研究表明，抗V.viscosus的灭活疫苗能产生一定的免疫效果（Vinitnantharat et al，1999），到目前为止还没有抗V.vulnificus的菌苗能在养殖生产上应用，但是一种带有西班牙和日本株的类毒素菌苗已通过实验阶段，并在养殖生产上得到广泛应用（Toranzo et al，1997）。

由典型性A.salmonicida引起的疖疮病也是用接种疫苗的方式得到成功控制。这种病原体已从淡水和海水鱼类中分离得到，目前来源于A.salmonicida的注射型含佐剂的疫苗已在冰岛研制成功（Gudmundsdottir et al，1997）。在革兰氏阳性菌引起的疾病中，链球菌病是开发疫苗的首选对象。这类疾病是由多种微生物引起的，近年来已利用分子生物学方法将其重新分类（Bercovier et al，1997），利用灭活细菌疫苗进行腹腔注射免疫，证明可使大鲮鲆、虹鳟和罗非鱼获得保护性免疫（Toranzo et al，1995；Akhlaghi et al，1996；Bercovier et al，1997）。

（2）病毒疫苗

一般通过注射或浸泡方式接种病毒性抗原后，鱼类能产生保护性免疫。但对于几种病毒病如VHS、IHN、斑点叉尾鮰病毒病和鲤春病毒病等而言，由于产生的抗体水平太低而使得这些病毒疫苗的商业价值不大（Dixon，1997）。用灭活病毒或重组技术得到的抗IPN疫苗已在挪威广泛使用，活体或灭活抗草鱼出血病疫苗已在我国广泛应用（Dixon，1997）。真鲷彩虹病毒（RSIV）对日本的水产养殖业构成较大威胁，用灭活的RSIV抗原接种鱼体，证明接种疫苗的鱼有更好的免疫能力（Nakajima et al，1997）。根据1996年第二届鱼类免疫学国际学术研讨会仪报告，已研制出应用于鱼类的病毒性疫苗有IPNV疫苗、VHSV疫苗、IHNV疫苗、SVC疫苗、GCHD疫苗、CCVD疫苗等6种，且几乎全部向基因重组疫苗发展。

（3）寄生虫疫苗

目前抗鱼类寄生虫疫苗仅有2种：小瓜虫疫苗和鲺病疫苗，且没有商业价值。但近年来针对不同寄生虫的免疫反应机理进行了研究，隐鞭虫病是免疫预防研究的主要对象之一，用活体隐鞭虫疫苗免疫后的虹鳟补体结合性抗体的研究显示接种的鱼对病原性鞭毛虫表现出良好的免疫保护能力（Li and Woo，1997）。通过接种疫苗来控制大麻哈鱼鲺也是一项富有挑战性的工作，这些研究工作为免疫学在治疗鱼体外寄生虫病方面展现了广阔前景（Roper et al，1995）。

3.根据疫苗的成分分类

（1）单价疫苗

由一种病原微生物获得，只对一种血清型的病原微生物有保护作用。

（2）多价疫苗

由一种病原微生物的若干型或多个毒株获得的疫苗，对同一种病原微生物的不同血清型或不同种的病原体有交叉保护作用。

（3）混合疫苗

由一种以上的病原微生物制成的疫苗，对一种以上的疾病有保护作用。人们普遍认为鱼类免疫系统的多样性和有效性都低于哺乳动物，但多价苗和单价苗却同样有效。如从V.anguillorun，V.salmonicida和A.salmonicida获得的疫苗，在抗疖疮病的效果上就比相应的疖疮病单价苗好得多，这可能是V.salmonicida和A.salmonicida间有免疫学的交叉反应，引起疖疮病和非典型疖疮病微生物抗原之间也存在着交叉保护。但交叉保护在一些疾病中表现出来，在另一些疾病中则不能表现。目前一般在疫苗的使用方面多使用多价苗，以避免疫苗对其他生物的不利影响。

（三）佐剂

佐剂是一种非特异性的增强或改变疫苗应答的物质，主要有三种类型：第一类是以矿物质乳胶为基质的佐剂，如氢氧化铝乳胶、皂土、硫酸铝、钾明矾等；第二类是以油为基质的佐剂，如弗氏不完全佐剂（FIA）、弗氏完全佐剂（FCA）、油包水型乳化佐剂、水包油包水型佐剂等；第三类是我国的以中草药莨菪作为佐剂，能增强疫苗的渗透性，促进鱼体的吸收（张念慈等，1990；越建培等，1995）。

在鱼的疖疮病疫苗开发研究实验中证实，佐剂对于注射型鱼用疫苗是一种必不可少的成分（Midtlyng et al，1996）。在大麻哈鱼的免疫实验中利用碱性铝或葡聚糖作为佐剂的注射型疫苗可以诱发鱼的获得性免疫，但时间较短。另有实验表明油性佐剂优于铝或葡聚糖，能使鱼获得更强的免疫效果，油性佐剂已在商品性注射型菌苗方面取得较大的应用面。但注射型疫苗中的佐剂通常会在注射部位发生反应，产生肉芽肿，这些反应有中等和重度不同情况，油性佐剂通常会发生严重反应，有时还会对鱼的产量造成影响（Midtlyng et al，1998）。目前有关减少油性佐剂影响的研究已有一些报道，如从分枝杆菌中提取的极性糖肽脂作为佐剂，免疫效果较好，但还停留在实验阶段（Hoel and Lillehaug，1997）。

（四）免疫应答和保护性免疫

目前一些鱼病的病原毒性机理已经得到阐明。人们对免疫应答甚至一些保护性抗原的细胞免疫应答的研究方法也已掌握。国内外研究人员已经建立了一些反映免疫应答和免疫保护之间关系的参数（Reitan and Secombes，1997）。在人工感染V.salmonicida的实验中，感染存活后的鱼体内有一种与抗细胞外多糖和致死性GCAT毒素复合物质相关的血清抗体（Brichnell et al，1997），在接种V.salmonicida后，接种鱼的保护性免疫虽然与免疫淋巴细胞增殖反应有关，但相关程度低于抗体应答（Midtlyng，1997）Palm等（1998）对V.auguillarum进行研究时发现，特异性抗体应答与通过注射、浸泡和口服抗原等方式进行的保护性免疫有关，但对后两种接种方式，只是在加强免疫后才产生体液免疫应答。

在水产养殖中，环境温度对免疫活性有重要影响，用接种了疫苗的大麻哈鱼来研究其抗体产生的情况，一种是将接种的鱼放养于2℃环境中进行养殖，另一种是放养于10℃的环境中养殖，结果显示，后者条件下产生的抗体远胜于前者（Eggset et al，1997）。

（五）母体免疫

在哺乳类和鸟类，免疫球蛋白可以通过胚盘、初乳或卵从母体传递给子代，以增强子代的保护能力，但在鱼类中此方面的研究结果还有所争议。因为研究发现，有一些鱼类的抗病能力可以从母体那儿得到，而有一些鱼类却不能。例如Brown等（1997）证实，注射大麻哈鱼体内的抗体，在其所产的卵中可以测出，而同样的大麻哈鱼抗耶尔森氏菌病的抗体就不能通过母体传递给子代。有研究表明，IPN、IHN病和细菌性肾病的抗体则能由母体传递给子代。

鱼类免疫学和疫苗学的发展潜力巨大。因为多种鱼病可以通过接种疫苗来得到控制，尤其是对于那些通过药物治疗无法控制的鱼病，如许多病毒病、寄生虫病等在接种免疫后成功地预防或控制了疾病的发生。免疫学家和疫苗学家们目前正密切配合，使基础科学与应用科学相结合，为疫苗的开发创造了良好条件。近年来的研究表明，活疫苗也有较大潜力，未来疫苗的开发与研究将主要集中于活疫苗的开发方面。分子重组技术的成熟与成功应用，为鱼类疫苗技术的开发提供了新的手段和途径，具有广阔前景。疫苗佐剂的研究和利用也是疫苗开发利用的不可缺少部分，有待于深入研究。