氨基甲酸乙酯的研究进展

洪 冰， 胡婷婷， 郑婷婷， 黄国忠， 李 敏， 张 曼

（1. 郑州市粮食科学研究所，河南郑州 450000；2. 上海旺旺食品集团有限公司，上海 200000）

氨基甲酸乙酯（又名尿烷、乌来坦、胺甲酸乙酯等），英文名Ethyl carbamate，是由氨基甲酸形成的一种酯。其分子量89.1，为无色无味晶体；沸点182～184 ℃， 熔点 48～50 ℃； 相对密度 1.1， 于 25 ℃下的蒸汽压力为48 Pa，燃烧点为92 ℃。氨基甲酸乙酯是一种强致癌物且不易挥发[1]。主要商业用途是生产农药，尤其是在杀虫剂中应用较多。

1 氨基甲酸乙酯的来源

氨基甲酸乙酯天然存在于发酵食品中，如酸牛奶、乳酪、黄酒、葡萄酒等，是发酵过程的伴随产物，具有潜在的致癌作用，并且乙醇对氨基甲酸乙酯的致癌性有促进作用[2]。多种化合物均可与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯，研究发现的有尿素、氨甲酰磷酸、瓜氨酸、焦碳酸二乙酯和氰化物等。1943年Nettleship证实氨基甲酸乙酯会导致皮肤癌、淋巴癌和肝癌等疾病，是一种多位点致癌物[3]，会进一步影响人体免疫系统。在国外，联合国粮农组织并制定了国际标准，规定氨基甲酸乙酯含量不得超过20 μg/L[4]。国际癌症研究机构也把氨基甲酸乙酯的分类由第2B组（或可能令人类患癌的物质） 改为第2A组（可能令人类患癌的物质）[5]。而我国并没有引起足够的重视，目前尚未制定发酵食品中氨基甲酸乙酯的限量标准[6]。由于我国发酵类食品众多，而氨基甲酸乙酯的污染又时有发生，所以随着人们生活水平的提高，对这方面的认识也会有所提高。

2 氨基甲酸乙酯的形成机理

由于原料的复杂性和微生物菌种的多样性，在食品发酵和贮藏过程中，氨基甲酸乙酯的形成方式也是多种多样。

加拿大、美国、捷克等国家分别对葡萄酒中氨基甲酸乙酯标准做出的限定，分别为30，15，30 μg/L[3]。葡萄酒中氨基甲酸乙酯是乙醇和尿素、瓜氨酸等氨甲酰类物质自发反应产生的，通过苹果酸-乳酸菌的精氨酸脱亚氨基酶途径（即ADI 途径） 和酵母的尿素循环途径代谢可以形成尿素和瓜氨酸，其含量与葡萄汁或葡萄酒中精氨酸含量、发酵温度、pH值和菌种性能等密切相关[7]。梁萌萌等人[8]研究发现，在葡萄酒生产的主要工艺参数中，酵母是一个重要的影响因素，酵母种类的不同会使氨基甲酸乙酯的含量有明显的差异。精氨酸含量的提高会导致氨基甲酸乙酯的含量上升。乳酸菌接种量的提高不会明显提高氨基甲酸乙酯的产量，但不同种类的乳酸菌产氨基甲酸乙酯的能力不同，也会对其含量有一定影响。但是，目前关于葡萄酒中氨基甲酸乙酯合成的主要路径还缺乏相关研究[9]。

研究发现，水果白兰地在发酵、蒸馏和陈酿阶段氨基甲酸乙酯的形成机理是不同的。在发酵阶段，果汁中的精氨酸经过酵母菌的发酵形成尿素，尿素与乙醇进一步反应形成氨基甲酸乙酯，而且随着发酵温度的升高，氨基甲酸乙酯形成速度将加快[10]。氨基甲酸乙酯形成的另一种途径是通过氢氰酸阴离子形成。氨基甲酸乙酯的前体物质氢氰酸氧化形成氰酸或异氰酸，进而与乙醇反应形成氨基甲酸乙酯[11]。在蒸馏阶段，氰酸和异氰酸等前体物质可与乙醇形成多种中间体，如氨基甲酸或氰酸乙酯，最终形成氨基甲酸乙酯，并以气溶胶的形式进行传输。在蒸馏阶段，EC含量随着蒸馏时间的延长而增加，随着乙醇体积分数的增加而降低[12]，因此可以通过适时的掐去酒尾，减少酒中的EC含量。在陈酿阶段，白兰地中EC的形成主要是EC前体物质通过金属离子的催化作用和光化学途径，发生氧化，再与乙醇发生酯化形成EC[13-14]。

3 氨基甲酸乙酯的毒性及其机理

研究发现，EC在生物体内的代谢与细胞色素P450有着紧密的联系，并主要通过3种途径代谢：一是P450将一小部分EC氧化为乙烯基-氨基-甲酸乙酯，在一定条件下形成乙烯基-氨基-甲酸乙酯环氧化物，并进一步合成DNA加聚物[15]，这种加聚物可导致DNA双链损坏并发生细胞癌变；二是90%以上的EC被肝内的酯酶分解为乙酸、氨和碳水化合物等，还有5%左右被动物以尿的形式排出体外；三是极少的一部分EC被P450氧化为N-羟基-氨基-甲酸乙酯，该物质能够诱导Cu2+调控的DNA损伤，这种损伤多作用于胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C） 的残基上。具体作用机理为：在Cu2+作用下，EC被P450氧化并产生NO和O2-·，它们进一步反应生成的过氧化氮与8 - N -鸟苷酸的脱嘌呤和8 -二氢- 2' -脱氧鸟苷有密切关系。而这两者均会诱导GC→TA的碱基交换，进而导致基因严重缺失或者突变。因此，在Cu2+作用下，8 - N -鸟苷酸的脱嘌呤和8 -二氢- 2' -脱氧鸟苷的作用是EC致癌的主要机理[4，16]。

4 氨基甲酸乙酯的检测方法

由于发酵食品中EC的含量都较低，且成分较繁杂，所以需要利用高精密度的仪器来完成定量检测和分析。目前，氨基甲酸乙酯的检测主要依靠气相色谱-质谱联用（GC-MS） 及其衍生法，GC-MS具有灵敏度高、选择性好和稳定性强等特点，使其广泛应用在多个领域中，但其费用高，样品前处理繁琐[17]。近几年，新增加的方法如GC-MS/MS和HPLCMS/MS，能某种程度上降低检测限，也能进一步简化其前处理过程[18]。OIV（International organism of vine and wine） 要求的EC检测方法为气质联用（GC-MS）结合选择性离子检测器。该方法适用于氨基甲酸乙酯质量浓度为10～200 μg/L时的酒精饮料[19]。除此之外，还有高效液相色谱-荧光法（HPLC-FLD）[20]，但是与GC-MS相比，其灵敏度不如GC-MS，但HPLC-FLD法操作简单，可用于生产企业的质量控制等。采用高分辨质谱为基础的GC-HRMS方法可以更精确地测出发酵食品中的氨基甲酸乙酯含量[21]。有研究发现[22]，以硅酸镁为载体的分离柱去除样品中的脂肪，用更加有效的前处理方法，同样可以提高发酵食品中氨基甲酸乙酯检测精度。

周勇等人[23]利用基质固相分散-气相色谱-串联质谱联用（MSPD-GC/MS/MS） 的测定方法对焙烤食品中的氨基甲酸乙酯进行检测，线性范围为5～500 μg/L， 相关系数R2=0.999 7，方法检出限2.5 μg/kg，标准加入 5～100 μg/kg的平均回收率为 95.40%～98.00%。结果表明，该方法标准曲线线性良好，且具有操作简便、可靠、灵敏度高等优点，可用于焙烤食品中的氨基甲酸乙酯检测。

徐小民等人[24]利用气相色谱-串联质谱法（GCMS/MS） 测定黄酒和酱油中氨基甲酸乙酯的含量。黄酒基体中氨基甲酸乙酯的加标回收率为97.4%～98.8%, RSD为4.0%～8.4%；酱油基体中氨基甲酸乙酯的加标回收率为96.2%～104.0%，RSD 为5.3%～10.0%。结果表明，该方法定量准确、操作简单、灵敏度高、定性确证可靠, 适用于黄酒和酱油中氨基甲酸乙酯的测定。

周玮等人[25]用全自动固相萃取-气质联用测定酒中EC的含量，研究采用了DB-225MS型色谱柱，并采用全自动固相萃取仪来提取物质，使酒中微量的氨基甲酸乙酯得到了良好的分离。该方法易于掌控、提高了精密度、定量准确且重复性好。由于该方法前处理稍简单，所以可以作为商检行业的替代方法来测定市售的几种酒类中的氨基甲酸乙酯。

刘丽斌等人[26]以乙酰胆碱酯酶对底物碘化硫代乙酰胆碱进行水解。根据氨基甲酸乙酯对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，测定氨基甲酸乙酯。用溴水-氢氧化钠溶液、次氯酸盐（如次氯酸钠、次氯酸钙等）、次溴酸盐和溴、氯等卤素单质[27-28]处理EC后，发现EC对乙酰胆碱酯酶的抑制率有了明显提高。该方法具有所用试剂成本低、操作简便、设备要求不高等特点。为进一步开发基于酶抑制原理的酒精饮料及发酵食品中EC快速检测方法技术及产品提供了理论和技术支持。

Ajtony Z等人[29]采用HPLC法对酒中的氨基甲酸乙酯含量进行检测，研究表明，该方法平均回收率为93.6%～103.4%。该方法灵敏度高，可用于酒类的EC检测。

国内外已有相关报道称，在酒精饮料中检测出氨基甲酸乙酯[30]。有研究采用三重四极杆质谱仪和超声乳化微萃取法（USAEME） 测定酒精饮料中的氨基甲酸乙酯含量。这也是第1次采用超声乳化微萃取法测定酒精饮料中的亲水性复合物[31]，具有一定的可行性。

对于企业或者监管机构，当面对大量的样品时，EC的快速检测方法显得尤其重要，目前EC的快速检测方法主要有酶抑制法、薄层色谱法、光谱法和免疫检测法等。但是目前EC快检方法重复性较差，而且前处理的操作稍繁琐，这些都限制了EC的快检发展，不利于监测发酵食品中EC含量和了解生产过程中EC的检测，因此发展EC快检方法迫在眉睫[18]。

5 氨基甲酸乙酯的控制

有研究表明[32]，对常温存储下黄酒中的氨基甲酸乙酯含量进行6年的跟踪检测，结果表明随着时间推移氨基甲酸乙酯的含量明显上升，pH值及酸度值基本不变。长期常温储存有氨基甲酸乙酯超过基准值的风险，对氨基甲酸乙酯的控制势在必行。

由于发酵体系多样且复杂，直接导致EC的形成途径多种多样，因此采用单一的控制EC含量的方法显然不可取，很难将EC全部清除。所以，要根据氨基甲酸乙酯的形成方式，建立相应的控制方法，以降低产品中的氨基甲酸乙酯的含量。

李加友等人[33]通过氨基甲酸乙酯脱氨酶对黄酒处理，将产品中EC含量降低到50 μg/L以下，并且处理前后黄酒的口感无明显变化。而且氨基甲酸乙酯脱氨酶生产成本较低，可以很好地进行商业化运用。因此氨基甲酸乙酯脱氨酶对黄酒和果酒等发酵食品中的氨基甲酸乙酯有很好的控制作用。

林文浩等人[34]采用自主新研制的黄酒特种助剂，助剂处理的工艺条件为：添加量0.8‰～1.0‰，在室温条件下搅拌60 min，静置24 h后进行过滤。结果发现，氨基甲酸乙酯平均去除率为55.2%，尿素平均去除率为45.3%，可有效降低氨基甲酸乙酯和尿素的含量。

除此之外，还有一些根据氨基甲酸乙酯的形成机理对其进行控制的方法：一是发酵原料中尿素的控制，可对发酵的大米进行多次淘洗，使大米中的尿素降低50%，但是同时也降低了原料的营养价值，影响发酵质量。二是工艺上的控制，如发酵温度。有研究表明，温度是促进酒中EC产生速率的重要因素[35]。由于发酵食品的风味受工艺条件影响较大，因此这种方法很少使用。三是利用诱变和基因工程手段选育高性能菌株，获得使精氨酸转化能力受阻的菌株，可有效降低氨基甲酸乙酯含量，但由于其安全性，此方法并未普及。但是，有研究发现[36]，在发酵食品中有效分离可消耗EC前体物质，但同时又保证发酵风味的菌株，并将其应用于同种发酵食品中，可以有效降低该发酵食品中EC含量。四是脲酶对尿素的分解，我国出口黄酒均采用该方法控制氨基甲酸乙酯的含量[33]。