基于RNAi技术抗黑条矮缩病水稻新品系的培育

朱文银　徐建第　杨连群　姜明松

摘要：水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）由介体灰飞虱以持久性不经卵方式传播。该病毒引起的水稻黑条矮缩病分布范围广、危害重。RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种重要的植物抗病毒基因工程策略，已广泛应用于植物抗病毒研究中。本研究利用已构建的包含P10 CP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体pRBSDV-CP3-bar，采用农杆菌介导转化水稻愈伤组织获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株，通过抗性筛选、PCR检测及分子杂交分析，获得2个抗RBSDV和Basta的稳定品系，并对其田间抗性及农艺性状表现进行了鉴定，为抗RBSDV水稻新品种（品系）的培育奠定了基础。

关键词：水稻黑条矮缩病毒；RNA干扰；反向重复序列；农杆菌介导

中图分类号：S511.035.3 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2018）11-0023-05

Abstract Rice black-streaked dwarf virus （RBSDV） is transmitted by the small brown planthopper （SPBH，Laodelphax striatellus Fallen） persistently. Rice black-streaked dwarf disease is one of the most wide spread and severe virus diseases. RNA interference （RNAi） is an important gene silencing phenomenon and has been widely used in the transgenic breeding for improving crops viral resistantce. According to the principle of RNA interference mechanism， a new RNAi binary vector named pRBSDV-CP3-bar， was constructed including the inverted-repeat sequence of P10 CP gene partial fragment and the marker gene bar with higher biosecurity，and was used to transform rice callus mediated by Agrobacterium in order to obtain anti-RBSDV and herbicide-resistant transgenic rice plants. After analyzed by PCR and northern blot，two anti-basta and highly RBSDV-resistant rice varieties KRBSDV2 and KRBSDV6 were obtained.Their performance of field resistance and agronomy traits were investgated. It laid a foundation for the breeding of new rice varieties （lines） resistant to RBSDV.

Keywords Rice black-streaked dwarf virus； RNA interference； Inverted-repeat sequences； Agrobacterium-mediated

水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）是引起水稻黑条矮缩病的病原物，该病毒属呼肠孤病毒科（Reoviridae）斐济病毒属（Fijivirus）成员之一[1]。RBSDV主要由昆虫介体灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久性不经卵方式传播，除侵染水稻外，还能侵染玉米引起玉米粗缩病[2]。水稻受该病毒侵染后主要表现为植株矮小丛生，不发棵，叶片细小浓绿，叶背、叶鞘和茎秆有早期蜡白色、后期黑褐色的短条纹不规则突起，严重发病株不能正常抽穗。发病田塊一般减产10%～40%，重病田甚至颗粒无收[3-6]。近年来，在黄淮流域粳稻区由于耕作制度和耕种方式的变化，灰飞虱冬前虫量基数逐年增长，由于田间杂草和禾本科作物可作为RBSDV的寄主，通过灰飞虱的食毒和传毒，该病很有可能在黄淮流域粳稻区大发生，对水稻生产构成新的威胁。江苏、山东、河南等省份一直将参试水稻品种的黑条矮缩病抗性鉴定结果作为新品种审定标准的重要约束性指标之一。目前生产上主要依赖化学农药控制介体灰飞虱来防治RBSDV，但由于灰飞虱的迁飞习性及传毒的瞬时性，化学防治效果不明显，且易造成环境污染。因此，选育抗病品种是防治水稻黑条矮缩病最为经济有效的方法。

RBSDV基因组分子量约占病毒粒子总分子量的15%～20%，其由10条双链RNA（double strand RNA， dsRNA）片段组成，按照其在聚丙烯凝胶电泳上的迁移距离由小到大，依次命名为S1—S10[7]；S1—S10编码蛋白功能已经基本明确，主要是RNA 依赖的RNA 聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等[8-10]。其中，S10编码的63000蛋白质（P10）为病毒主要外层衣壳蛋白（coat protein， CP）。P10蛋白质在体外或酵母细胞内都能通过N端230个氨基酸相互作用形成多聚体。进一步研究结果表明，纯化的P10蛋白在溶液中主要形成三聚体。P10蛋白形成三聚体的结构对于RBSDV病毒粒体衣壳的组装、复制及病毒传播具有重要作用[11]。

在种质资源抗性筛选中，目前尚未发现对RBSDV病毒免疫的水稻材料。虽然少数水稻资源具有一定抗性，但由于微效基因作用效应低，难以在水稻育种中利用[12]。若用常规方法培育抗病品种存在育种周期长、效率低，抗病基因与不良性状连锁等问题。随着分子生物技术的发展，利用基因工程技术改良现有作物、赋予作物对病毒的抗性，在植物抗病毒病工程中将发挥巨大作用，其中利用较多的是RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术，利用该方法能髙效、特异性地控制病毒病。

RNAi是指外源性或内源性双链dsRNA特异性结合并降解靶标基因mRNA，从而达到沉默靶标基因的效果，致使相应的功能表型缺失[13，14]。RNAi的本质是转录后的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），发生沉默的基因转录仍然正常进行，但转录的mRNA在细胞质中发生了序列特异性降解，从而导致基因不能正常表达成蛋白质[15]。dsRNA的形成存在多种可能的途径，许多研究表明，在植物体内产生dsRNA的最佳方法是转化具有发夹结构RNA（hair-pin RNA，hpRNA）的外源基因，根据RNA干扰原理，发夹结构中的dsRNA将会介导靶标基因mRNA降解，从而实现对靶标基因表达的抑制，使植株获得病毒抗性。

RBSDV的CP基因编码病毒的外壳蛋白，主要负责病毒颗粒组装、复制等功能。本研究利用已构建的包含CP基因部分片段（CP基因3′端部分序列，不编码任何蛋白）的反向重复序列和bar基因（抗除草剂Basta）的RNAi双元表达载体pRBSDV-CP3-bar，通过农杆菌介导转化水稻成熟胚获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株，经抗性鉴定、PCR检测及Southern blot、Northern blot分析，筛选到稳定的转基因水稻抗性株系且田间农艺性状表现良好，为抗RBSDV水稻品种（品系）的培育奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试虫来源及植物材料

带RBSDV病毒的灰飞虱成虫来自济宁市鱼台县麦田，用感病品种武育粳3号的幼苗（2～3叶期）饲养，饲养温度为25～27℃，光照周期 16L∶8D。

转基因受体品种为圣稻14，属早熟中粳水稻品种。该品种高感黑条矮缩病，由本研究室保存。

1.2 菌株与试剂

本试验所用生物工程菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α及农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，均由本实验室保存。

植物表达载体pRBSDV-CP3-bar及探针由山东农业大学朱常香教授惠赠，包含CP基因部分片段反向重复序列、水稻PLD（phospholipaseD）基因的内含子和标记基因bar基因（图1）。

PCR所用dNTPs、Taq DNA 聚合酶、HindⅢ、核酸標准分子量（DL 2000 Plus、DNA Ladder Mix）均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Trizol购自 Invitrogen 公司、HybondTM-N+、Northern blot kit购自Roche；其他试剂除文中另有注明外，均为国产分析纯或化学纯。

1.3 遗传转化及抗性筛选

通过农杆菌介导法将阳性克隆载体pRBSDV-CP3-bar转入受体品种圣稻14中。参照姚方印等[16]的方法进行水稻成熟胚愈伤诱导，将诱导出的愈伤组织与已有的阳性农杆菌菌液共培养后，用15 mg/L Basta进行3次抗性筛选，经诱导及分化，最后获得阳性转基因植株。

1.4 转基因水稻总RNA与基因组DNA提取

利用传统Trizol法提取水稻叶片总RNA，cDNA的合成参照杨杰等[17]的方法进行。DNA提取采用CTAB法，参照Murray等（1980）[18]的方法进行了部分改动。

1.5 转基因植株PCR分析

根据已发表的RBSDV的S10信息，其中CP基因在GenBank中注册号为JN008880.1，蛋白注册号为AEQ75482.1。我们在CP基因3′端附近设计引物（上海英俊生物技术公司合成），以转化植株基因组DNA为模板进行PCR扩增，目的片段RBSDV-CP3为CP基因的部分序列，因整个全序列形成发夹结构，扩增困难，所以仅扩增hpRNA的茎部分序列。目的片段扩增长度为500 bp，引物序列为：RBSDV-CP3-F：5′-AAGTGCCACTAGTACTTCAAC-3′；RBSDV-CP3-R：5′-TTAATAGCCTGTCCCTATCAG-3′。

PCR 扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.6 转基因植株的 PPT 抗性检测

水稻分蘖中期，于天气晴朗时用棉签蘸取浓度为1 g/L的除草剂Basta（有效成分PPT）涂抹转化植株叶片长度1～2 cm，7 d后观察叶片涂抹处是否黄化，鉴定转化植株是否成功转入目的基因。

1.7 黑条矮缩病抗性人工接种鉴定

转基因植株的黑条矮缩病抗性人工接种鉴定参照周彤等[19]的方法进行：带毒灰飞虱循回时间为12～15 d，接种时间48～72 h，水稻接种苗龄0.5～2.5叶，有效接种强度4～20虫/苗。根据发病率评价田间抗性水平。分级标准参照水稻条纹叶枯病抗性评价标准。免疫：发病率为零；高抗：发病率0.1%～5%；中抗：发病率5.1%～15%；中感：发病率15.1%～30%；感病：发病率30.1%～50%；高感：发病率大于50%；后四个级别统一记为感病。

1.8 抗病转基因植株的Southern blot分析

将提取的总DNA经Hind Ⅲ酶切后，转移到HybondTM-N+尼龙膜，80℃固定2h。Southern杂交分析参照Sambrook等[20]的方法进行。以RBSDV-CP3基因和bar基因为探针，采用随机引物法合成，用[α32P]dCTP进行标记。

1.9 转基因植株的Northern blot分析

对提取的转基因植株总RNA 进行Northern blot分析，参照朱俊华等[21]的方法。

1.10 农艺性状调查

待水稻成熟期对野生型植株和筛选到的抗性转基因株系的产量相关性状如株高、穗长、有效穗数、每穗实粒数、结实率、千粒重进行调查，再用SPSS软件对结果进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 T0代转基因植株的Basta鉴定和PCR检测

待遗传转化获得的转基因苗生长至6叶期，在叶片上涂抹除草剂Basta，7 d后调查显示：共有9株呈阳性。用设计的引物进行PCR检测，以野生型圣稻14为阴性对照，结果显示，Basta鉴定表现为阳性的植株均可扩增出500 bp的目的片段（hpRNA的茎部分），而野生型圣稻14中未扩增出特异带（图2）。表明经除草剂鉴定为阳性的转基因植株PCR均呈阳性，说明外源基因已整合到圣稻14的染色体基因组中。

2.2 T1代转基因植株的RBSDV抗性检测

转化pRBSDV-CP3载体的T0代阳性植株自交结实，获得T1代株系，利用叶片涂抹Basta 的方法，筛选出T1代阳性转基因植株。每个株系各选取50株阳性植株，用带毒灰飞虱接种RBSDV，以野生型圣稻14为对照。接种30 d后的调查结果显示，有2个转基因株系的RBSDV发病率在5%以下，远低于对照和其它转化株系的发病率，表现为抗性株系（表1）。

2.3 抗病转基因植株的Southern blot分析

提取抗病转基因植株KRBSDV2、KRBSDV6和野生型圣稻14的总DNA，经HindⅢ酶切后，电泳，转移到尼龙膜上，分别用RBSDV-CP3基因和bar基因为探针，进行Southern杂交。杂交结果（图3）显示，野生型圣稻14无任何杂交条带，而KRBSDV2出现1条杂交带，KRBSDV6出现2条杂交带，表明外源基因已整合于水稻的基因组中，且在KRBSDV2中至少存在1个拷贝，在KRBSDV6中至少存在2个拷贝。此外，我们对获得的这两个转基因水稻抗性株系加代，分别检测了RBSDV-CP3基因和bar基因在这两个转基因植株后代群体中遗传分离情况。结果表明，在所选择的转基因植株中，外源基因在转基因水稻中遵循孟德尔遗传分离规律，表明外源基因在转基因植株中能稳定地遗传和表达。

2.4 T2代转基因的Northern blot分析

为了分析转基因植株中的靶基因在转录水平上的表达和积累情况，以未接种病毒的野生型水稻作为对照，提取抗病和感病的转基因植株葉片总RNA，分别用RBSDV-CP3基因和bar基因为探针，进行Northern blot杂交。结果（图4）显示：转基因植株均显示特异性的杂交信号，而对照野生型水稻中没有检测到任何杂交信号。同时发现，在RNA上样量相等的情况下，抗病转基因植株中RNA的积累量明显低于感病植株中RNA的积累量，表明转基因植株对病毒的抗性与靶基因mRNA的积累量呈负相关。由此说明，转基因植株所产生的抗病性是由RNA介导的，也暗示了病毒的复制在转基因植株中受到明显抑制，即病毒RNA可能发生了降解。

2.5 转基因品系农艺性状分析

对转RBSDV-CP3的两个稳定株系KRBSDV2、KRBSDV6的农艺性状进行分析，结果表明，两个抗病株系与受体圣稻14在株高、穗长、有效穗数、每穗实粒数、结实率、千粒重等6个性状上无显著差异（表2）。说明这两个转基因株系除抗病性较对照圣稻14有很大提高外，其它农艺性状较圣稻14相近，具有应用于实际生产的潜力。

3 讨论与结论

RNAi是一项高效沉默目的基因干扰特定生命过程的有效技术，作为新兴的基因阻断技术具有明显的优势，已被广泛应用到动植物功能基因组和植物抗病研究中。Hayakawa等[22]将水稻条纹叶枯病毒（Rice stripe virus， RSV）外壳蛋白CP基因导入水稻，结果发现转基因水稻对RSV有一定抗性。Shimizu等[23]对RBSDV基因组分P9-1进行干扰，发现可以达到抗病效果。基于同样原理，本研究利用已构建的包含P10 CP基因部分片段反向重复序列和生物安全性更高的标记基因bar基因的RNAi双元表达载体，通过农杆菌介导方法转化水稻愈伤组织并获得抗黑条矮缩病和抗除草剂的转基因水稻植株。利用其育成的高代抗性株系的重要农艺性状与野生型无明显差异，可为抗黑条矮缩病水稻新种质的创制提供了很好的研究基础。

参 考 文 献：

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