滇黄精不同外植体无菌体系的建立

农艳丰 李健 吴永振

摘 要：目的：建立滇黄精外植体组织培养再生体系，为完善无菌快繁技术体系提供技术基础。方法：以根状茎、叶、花药为外植体，就不同的灭菌方案、不同浓度的激素对外植体进行诱导试验。结果：根状茎芽点最好的灭菌方案为75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的处理组合，诱导芽点生长的适宜培养基为6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L；嫩叶片最佳的灭菌处理为0.1%HgCl2 13min，可控制污染率为18.7%，较好的诱导培养基为6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L。75%酒精20s+0.1%HgCl2 10min灭菌处理是花药较理想的灭菌方案，以KT1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L为最适宜的诱导愈伤组织培养基。结论：试验中不同外植体均可完成再生体系。

关键词：滇黄精；无菌体系；外植体

中图分类号 S507 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）22-0021-04

Abstract：Polygonatum kingianum coll. et Hemsl，is one of the sources of Chinese drug，Polygonatum sibiricum. In order to establish a tissue culture regeneration system of the extract of Polygonatum kingianum coll. et Hemsl，and provide a technical basis for the establishment of a sterile rapid propagation technology system. Rhizomes，leaves and anthers were used as explants，and different sterilization schemes and different concentrations of hormones were used. The implant was subjected to an induction test. The results showed that the best sterilization scheme for rhizome buds was 75% alcohol 30s + 0.2% HgCl2 15min treatment combination. The suitable medium for inducing bud growth was 6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L；the best sterilization treatment of young leaves was 0.1% HgCl2 13min，with the control pollution rate was 18.7%；And the preferred induction medium was 6-BA 0.5mg/L+NAA 1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L. 75% alcohol 20s+0.1% HgCl2 10min sterilization was an ideal sterilization scheme for anthers. KT 1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L was the most suitable callus induction medium.In this experiment，different explants could complete the regeneration system，which can provide a scientific basis for the tissue culture and rapid propagation of Polygonatum kingianum coll. et Hemsl.

Key words：Polygonatum kingianum coll. et Hemsl；Sterile system；Explants

滇黄精（Polygonatum kingianum coll.et Hemsl），为百合科（Liliaceae）黄精属（Polygo-natum）的多年生草本植物，是传统的道地药材，在我国主要分布于云南、广西等地[1]。药用历史久远并且有确切的临床疗效，为《中华人民共和国药典》2015版收录的3种中药黄精之一[2]。现代研究表明，黄精具有免疫调节、延缓衰老、调血脂、降血糖、抗运动疲劳、抗肿瘤、抗动脉硬化、抗炎、抗抑郁、抗病毒、保护心血管、保护心肌细胞等保健功能[3-5]，并且含有丰富的多糖、淀粉及其他有益成分，味道甘甜，口感好，是极佳的药食同源植物[6]。目前，市场上滇黄精以野生资源为主要来源，人工种植尚处于探索阶段，急需良好的种苗来源。

国内外在对黄精的组织培养技术方面的研究多集中在黄精和多花黄精上，以其根状茎、茎段、种子、叶等器官为外植体，进行组织培养技术研究。比如，周建军等[7]以多花黄精的种子为外植体，获得了36%的发芽率；裴莉昕等[8]及朱伍凤[9]发现黄精嫩叶可诱导愈伤组织，与嫩茎和根状茎对比分析，嫩叶更容易诱导愈伤组织，而且叶片的褐化现象较少；周新华等[10]研究表明，嫩茎的萌发力明显低于根茎芽，根茎芽相较于嫩茎更合适用作外植体材料；李莺等[11]研究表明，黄精的根状茎、嫩茎及叶片均能诱导愈伤组织，继代增殖良好；汤盛杰等[12]研究表明，6-BA和NAA配合使用能在短时间内增殖黄精不定芽，而且不定芽生长发育好，没有畸形叶片产生；徐忠传等[13]研究表明，培养基中添加6-BA时，多花黄精的不定芽重量、数量和综合质量等效果最好，对不定芽增加最为有利。滇黃精组织培养技术方面的研究报导仅有许丽萍等[14]以滇黄精根状茎嫩芽为外植体，设计了不同的实验，萌发率并不高。

本试验以百色本地产的滇黄精作为材料，采用不同的外植体进行灭菌诱导，探索滇黄精组织培养的无菌体系，为完善无菌快繁技术体系提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 植物材料为健壮、无病害的滇黄精带芽根状茎。3月份时将根状茎种植在营养土中，待其成长，长出叶子并开花。叶片材料为鲜摘材料。花药选取长度为10～20mm的未开放花蕾，在3～5℃的冰箱中处理48h。

1.2 试验方法

1.2.1 根状茎芽点灭菌及初代培养 将根状茎用软毛刷对其表面的泥土等物质进行刷洗，再流水冲洗根状茎表面。从根状茎上切取芽点，芽顶往下2～3cm，在超净工作台上使用灭菌剂进行灭菌，将灭菌好的芽点接种到培养瓶中。培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+KT（0、1.0）mg/L+NAA（0.2、0.5、3.0）mg/L+2，4-D（0.5、1.0、2.0、3.0）mg/L。10d后統计污染率及死亡率，30d后统计萌芽率，重复3次。

1.2.2 叶片灭菌及初代培养 剪取叶片，用小毛刷在流水下对其表面及背面刷洗，然后在超净工作台上进行灭菌。将灭菌好的叶片去除叶缘后，切成5mm×5mm的小片，接种到培养基中。培养基设置为MS+6-BA（1.0、2.0）mg/L+NAA（1.0、2.0、3.0）mg/L，10d后统计污染率，30d后统计诱导率，重复3次。

1.2.3 花药灭菌及初代培养 将处理过的滇黄精花蕾在超净工作台上进行灭菌。将灭菌好的花蕾小心剔开花苞，用镊子小心地将里面的花药取出，接入到培养基中。培养基为MS+KT 3.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L和 B5+KT 3.0mg/L，+2，4-D 3.0mg/L。10d后统计污染率，30d后统计诱导率，重复3次。

相关计算公式如下：

污染率（%）=污染外植体个数/接种外植体数×100；

死亡率（%）=死亡外植体数/接种外植体数×100；

萌芽率（%）=萌芽外植体数/接种外植体数×100；

诱导率（%）=产生愈伤组织个数/接种外植体数×100

1.3 培养条件 pH值为5.8～6.0，光照强度35～46μmol·m-2·s-1，光照时间为12～14h/d，温度为26～28℃。

2 结果与分析

2.1 根状茎芽点的灭菌效果和初代培养情况

2.1.1 根状茎芽点 由表1可知，使用0.2%的HgCl2配合75%酒精灭菌，随着0.2%HgCl2的处理时间逐渐加长，根状茎的污染率随之降低，灭菌效果越好，但0.2%HgCl2的处理时间超过15min后，外植体死亡率也随之上升。各个处理之间均达到极显著差异。综合外植体的污染率和死亡率考虑，75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的处理组合，是根状茎芽点较为理想的灭菌方案。

2.1.2 根状茎芽点 接种的根状茎芽点，在培养8～10d时，在原生芽眼周围形成1～3个圆突状萌芽点，萌芽点呈淡白绿色，直径约1mm；20d左右，芽突长至3～5mm，并在根状茎有伤口的区域形成一层黄白相间呈颗粒状的愈伤组织；30d的时候，长势较好的芽有16～22mm高，芽根部直径3～5mm，在芽旁边芽点渐渐增加，每个带芽根状茎上约有4～6个芽点。从表2数据看出，除了处理3和处理6没有显著差异，其他处理均达到极显著差异。3种激素配比就能较好的诱导芽的生长，以6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L为萌芽率的最高配比，萌芽率为62.9%。

2.2 叶片的灭菌效果和初代培养情况

2.2.1 灭菌效果 由表3可知，平均污染率除处理6、7无显著差异，其他均达到极显著差异；平均死亡率则处理1和处理2无差异、处理3和处理无差异，其他均有显著差异。0.1%HgCl2溶液处理时间在18～20min时，叶片的污染率最低，为5.7%。处理时间为10min时，开始对叶片的生命力有影响，死亡率为3.1%，当处理时间为20min时，叶片死亡率达到42.9%。综合表3的结果可得出最佳的叶片灭菌时间为0.1%HgCl2、13min。

2.2.2 叶片的初代培养结果 由表4可知，处理1和处理5无显著差异，其他处理均达到极显著差异。本试验以

1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的激素来诱导叶片生长愈伤组织。在叶片接种9～12d，各培养基均开始出现部分叶片微向上或向下卷曲，在叶片切口周围变淡黄色，在叶片营养物质运输方向两端的切口有加厚、颜色加深的现象。15d后，叶片开始有在切口生长愈伤组织。结果表明，不同浓度的6-BA、NAA、2，4-D溶液配合使用，对叶片愈伤组织的诱导有较好的效果，诱导率可达28%以上，最高达46.0%。

2.3 花药的灭菌效果和初代培养情况

2.3.1 灭菌情况 由表5可知，处理2和处理5无显著差异。使用75%酒精配合0.1%HgCl2溶液使用，对花药的灭菌效果较好，相同的酒精灭菌时间前提下，污染率随着升汞灭菌时间的加长而降低；在升汞灭菌时间相同的情况下，酒精时间的加长对灭菌效果更好。综合表5试验结果对比，75%酒精灭菌20s配合0.1%HgCl2溶液10min灭菌是花药较理想的灭菌方案。

2.3.2 初代培养结果 接种到培养基上的花药，在接种后10d时开始形成花药愈伤组织。开始形成前，花药表面稍微收缩，再在花药形态学上端出现淡绿色的新生点。在后续生长中愈伤组织4～6d生长1mm，在接种后50～60d，愈伤组织基本定型，约长到3～5mm，不再生长。由表6可知，各个处理间均达到极显著差异，在2，4-D 3.0mg/L、KT 1.0mg/L含量时，愈伤组织的诱导率可达69.4%。

3 结论

本试验中，根状茎芽点最好的灭菌方案为75%酒精30s+0.2%HgCl2 15min的处理组合，诱导芽点生长的适宜培养基为6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+2，4-D 0.5mg/L。嫩叶片最佳的灭菌处理为0.1%HgCl2、13min，可控制污染率为18.7%，较好的诱导培养基为6-BA0.5mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D 3.0mg/L。75%酒精灭菌20s配合0.1%HgCl2溶液10min滅菌则是花药较理想的灭菌方案，KT 1.0mg/L+2，4-D3.0mg/L是最适宜的诱导愈伤组织培养基。

4 讨论

根据资料显示，离体植物在组培过程中，植物组织的发生和形成，与外植体的生理状态和它的内源激素含量有重要关系[15]，因而要提高初代培养时根状茎不定芽的诱导率。本试验通过NAA、2，4-D、6-BA、KT等植物生长调节剂可以诱导芽点生长不定芽、诱导叶片及花药生长愈伤组织。选择外植体时，根状茎宜选择1～3年生，生长健壮，无病虫害，多隐芽，无过多伤口和过多根系的茎段；叶片选择刚生长的健康鲜嫩叶片；花药选取长度为10～15mm的未开放花蕾，花蕾营养状态和生理状态都比较好，能提高花药诱导的成功率。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第15卷）[M].北京：科学出版社，2000.

[2]国家药典委员会.中国药典，一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：306.

[3]郑虎占，董泽宏，佘靖，等.中药现代研究与应用（第五卷）[M].北京：学苑出版社，1998：4071-4074.

[4]柳威，林懋怡，刘晋杰，等.滇黄精研究进展及黄精研究现状[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（14）：246-253.

[5]陈辉，冯珊珊，孙彦君，等.3种药用黄精的化学成分及药理活性研究进展[J].中草药，2015，46（15）：2329-2338.

[6]周建金，罗晓锋，叶炜，等.多花黄精组织培养技术[J].三明农业科技，2012，3（124）：27-31.

[7]周建军，罗晓峰，叶炜，等.多花黄精种子繁殖技术的研究[J].种子生产，2013，01（32）：111-113.

[8]裴莉昕，纪宝玉，陈随清，等.黄精不同外植体对愈伤组织诱导的影响[J].时珍国医国药，2017，28（8）：1995-1997.

[9]朱伍凤.药用植物黄精的繁育技术研究[D].杨凌：西北农林科技大学，2013.

[10]周新华，曾满生，肖智勇，等.多花黄精嫩茎与根茎芽离体培养技术[J].经济林研究，2014，32（4）：68-72.

[11]李莺，罗明志，罗雯，等.黄精的组织培养与植株再生[J].西北农业学报，2011，20（8）：159.

[12]汤盛杰，姜程羲，赵国利.地藏黄精组织培养技术[J].安徽农学通报，2008，14（21）：219.

[13]徐忠传，何俊蓉，周静亚，等.6-BA浓度对多花黄精不定芽增殖数量和繁殖系数的影响[J].安徽农业大学学报，2006，33（1）：105-107.

[14]许丽萍，唐红燕，贾平，等.滇黄精根茎芽组织培养技术研究[J].南方林业科学，2018，46（01）：33-37.

[15]叶兴国，佘茂云，王珂，等.植物组织培养再生相关基因鉴定、克隆和应用研究进展[J].作物学报，2012，38（2）：191-201.

（责编：张宏民）