循环肿瘤细胞检测在乳腺癌预后评估中的作用及与乳腺癌分子分型的关系

盖希 范凤凤 李占文

1869年澳大利亚Ashworth[1]首次在因癌症死亡后的患者血液中发现了循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。目前已在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌和肾癌等多种恶性肿瘤患者血液中发现CTC存在，CTC被定义为自发或因诊疗操作引起的、由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞[2]。乳腺癌已成为中国女性发病率最高的恶性肿瘤，占女性新发肿瘤的15%[3]。对乳腺癌发病机制、治疗、疗效以及预后评估的研究显得尤为重要。CTC被称为“液体活检”工具，能够实时、动态地监测疾病的变化，评估疗效；同时由于样本取材方便、可反复性操作、几乎没有创伤等优点而逐渐被关注。CTC检测已经被美国国家食品药品监督管理局（FDA）及中国国家食品药品监督管理总局（SFDA）批准，用于转移性乳腺癌（metastatic breast cancer，MBC）预后的评估[4-5]。本文就 CTC 在乳腺癌预后评估中的作用及与乳腺癌分子分型的关系作一综述。

1CTC的检测

大多数的实体肿瘤外周血中均可检测到CTC，但数量稀少，几乎是每10万～100万个白细胞中只有1个CTC[6]。CTC的检测包括富集和分离两个系统：一是以

CTC细胞大小、密度、阳性或者阴性免疫选择为基础的富集，二是以核酸、免疫学为基础的检测及抗原测定。常用的CTC富集方法有：免疫磁珠分离法[7]、黏附分离法、膜滤过法、梯度密度离心法、OncoQuick分离法[8]以及免疫磁珠分离和膜滤过法联合的富集方法。常用的CTC检测方法有：免疫细胞化学法、流式细胞术、激光扫描技术、核酸检测技术、差减富集技术与免疫荧光染色-染色体原位杂交的整合技术（SET-iFISH）、CTC芯片、CTC-iChip[9]、AdnaTest Cancer 癌细胞检测系统[10]以及上皮细胞免疫斑点法[11]。而CellSearch系统是将富集和检测过程紧密结合[12]，也是唯一被FDA批准可用于临床的CTC检测系统，并相继用于MBC、转移性结直肠癌和转移性前列腺癌的临床预后评价。但由于依赖于细胞表面表达上皮细胞黏附分子（EpCAM）的CTC才能用于CellSearch系统检测，且检测费用昂贵，大规模的临床应用在目前仍然难以推广[12-13]。

2 CTC在乳腺癌中的检测与应用

2.1 CTC在早期乳腺癌中的检测与应用 Rack等[14]在化疗前对2 026例早期乳腺癌患者行CTC检测，检出率为21.5%（435/2 026）；李蕾等[15]对26例早期乳腺癌患者行CTC检测，检出率为23.1%（6/26）；说明乳腺癌的侵袭和微转移在疾病发生的早期就已经出现了，乳腺癌一开始就是一种全身性疾病。Lucci等[16]首次证实CTC对非MBC的预后评估作用，通过对302例Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者进行临床研究，发现7.5ml外周血中检测到CTC 的患者无瘤生存（disease free survival，DFS）和总生存（overall survival，OS）明显降低，化疗前检测出的CTC数目与患者的复发和死亡风险呈正比。Rack等[14]研究发现在早期乳腺癌患者中，CTC检出率与淋巴结转移有关，淋巴结阴性者检出率为19.7%（136/692），而阳性者检出率为22.4%（299/1 334），两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；但CTC检出率与肿瘤大小、组织分级及激素受体状态无关；并得出结论患者外周血中CTC≥5个/30ml与不良预后有关，有可能作为DFS和OS的独立预测因子。李蕾等[15]在11例辅助治疗患者中发现有1例检出CTC（数目为100个/7.5ml），随访发现影像学及血清肿瘤标志物均正常，穿刺病理证实右锁骨下淋巴结转移。这些研究说明CTC对早期乳腺癌患者的预后有重要的预测作用，但仍需要寻找更完善的检测方法和统一的检测标准，来为临床工作提供理论依据。

2.2 CTC在MBC中的检测与应用 大约40%～80%的MBC患者外周血中可检测到CTC[15,17-18]，其中超过50%的患者CTC≥5个/7.5ml，说明MBC肿瘤负荷大，更容易检测出CTC，因此目前的研究大多是围绕MBC开展的，主要包括MBC的疗效评估和预后预测。

2.2.1 CTC检测对评估疗效的作用 一直以来，CT、MRI和正电子发射型计算机断层显像（PET）等影像学检查被认为是乳腺癌疗效评估和随访监测的重要方法，但是，由于对放射线损伤的顾虑和昂贵的检查费用，使得影像学检查的可重复性受到限制。近年来，学者们通过对CTC的研究，发现其在MBC疗效评估上有更大的意义。李伟等[17]应用膜滤过结合激光扫描细胞数，对136例MBC患者每3个化疗周期后行CTC检测，发现CTC数目的改变与病情的转归显著相关（P＜0.01）；化疗后CTC数目不变或下降的患者预后较好，而CTC数目增加的患者预后差。他们认为CTC检测可用于MBC化疗后疗效的评价。Liu等[19]进行的一项前瞻性研究证明MBC患者CTC与影像学评估疾病进展密切相关，甚至比影像学改变更早。在化疗前后连续收集外周血，动态监测CTC数目变化，发现CTC数目在治疗后3～4周出现改变，而影像学改变却需要9～12周。MBC治疗的目的是减轻肿瘤负荷，改善患者的生活质量，延长寿命，CTC检测对MBC疗效的评估具有重要的作用，可以减少无效治疗对患者身体的伤害和经济上的负担，是否可以取代传统的影像学检查方法应用于临床，还需要更多的研究来印证。

2.2.2 CTC检测对预后的评价 Cristofanilli等[20]应用CellSearch系统检测MBC患者外周血中的CTC，发现治疗前CTC是无进展生存期（progression free survival，PFS）和OS的独立预后因素。通过对177例MBC患者的研究发现，化疗前CTC≥5个/7.5ml的患者较CTC＜5个/7.5ml的患者PFS（2.7个月比7个月）和OS（10.1个月比18个月）明显缩短；同时，随访监测也发现CTC≥5个/7.5ml也是患者预后差的一个因素。随后的多项临床研究结果均显示CTC与MBC的预后有关，是一项独立的预后因子[5,21-23]。而李伟等[17]的研究显示CTC初次计数并不能预测患者疾病的最终转归，只有随访过程中CTC数目变化与患者预后明显相关；另外，临床病理因素与治疗前后的CTC数目的变化均无明显相关性。边莉等[24]开展的一项多中心、前瞻性的研究结果表明，MBC患者治疗前基线CTC≥5个/7.5ml与CTC＜5个/7.5ml的患者治疗3～4周PFS分别为30.4和42.0周，治疗6～8周PFS分别为33.4和42.0周，不同基线水平CTC患者PFS比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。虽然这两个研究结果与Cristofanilli等[20]稍有不同，但是治疗前CTC＜5个/7.5ml的MBC患者的PFS却明显延长，分析原因可能是由于随访时间过短，尚不足以反应MBC的PFS，因此需要随访更长时间来验证基线水平CTC是否可以作为判断MBC预后的指标。远处转移是乳腺癌死亡的主要原因，影像学检查方法对实体瘤的检出有重要的意义，而对于无可测量病灶的患者影像学检查方法的作用相对较弱。CTC检测可以实时监测病情，较影像学检查能更准确、及时地判断病情的变化。李蕾等[15]对240例MBC患者进行多因素分析显示，CTC水平与骨转移明显相关（P＜0.05），与肺转移、肝转移、脑转移、淋巴结转移及软组织转移均无相关性（均P＞0.05）。

CTC检测对评价MBC疗效和预后具有重要的作用。在临床工作中，通过对CTC的动态监测，可及时准确地发现转移病灶，从而进行针对性地治疗，最大限度地减轻不良反应，提高患者的生活质量。

3 CTC与乳腺癌分子分型的关系

2013年St.Gallen国际乳腺癌研讨会共识根据基因分析或免疫组织化学结果将乳腺癌分为4种不同亚型[25]：（1）Luminal A 型：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）均阳性，原癌基因人类表皮生长因子受体2（HER-2）阴性，Ki-67＜14%。（2）Luminal B 型：分为 HER-2阴性和HER-2阳性。HER-2阴性为ER阳性，HER-2阴性，同时满足下列其中1条：Ki-67≥15%或PR阴性；HER-2阳性为ER阳性，HER-2过表达或扩增，Ki-67及PR表达水平不限。（3）HER-2过表达型。（4）基底细胞型（基底细胞表型，ER、PR和HER-2均阴性）。基底细胞型乳腺癌是指具有基底细胞基因表型并不同程度地表达基底细胞角蛋白和肌上皮标记物的乳腺癌；三阴性乳腺癌（TNBC）是ER、PR与HER-2均阴性的乳腺癌。TNBC与基底细胞型乳腺癌大约有80%的重合。分子分型的提出使人们对乳腺癌重新认识[26]，同时在治疗上也有了新的突破。在传统的手术、化疗、放疗和内分泌治疗的基础上增加了靶向治疗，给HER-2过表达型患者带来明显的临床获益。

外周血中的CTC起源于原发或转移肿瘤病灶，检测原发肿瘤的基因表型可以指导临床治疗，CTC是否也像原发肿瘤一样表达ER、PR和HER-2？王丽娟等[27]通过对53例浸润性乳腺癌的分子分型与CTC关系的研究，发现Luminal B型和TNBC患者与Luminal A型在CTC计数上有明显差异（均P＜0.01)。李蕾等[15]发现HER-2阳性患者的CTC检出率低于HER-2阴性患者（51.8%vs 79.6%），差异有统计学意义（P＜0.05）；而 ER是否表达对CTC检出率并无影响。Liu等[28]将＞30%的CTC过表达HER-2定义为CTC-HER-2阳性，CTCHER-2阳性率和阴性率分别为 48.1%（13/27）和100.0%（9/9）。McNemar’s检验表明 CTC 的 HER-2表达情况与肿瘤组织明显不同（P＜0.01）。目前有多项研究报道CTC中ER、PR和HER-2的表达情况与原发肿瘤并不一致，这可能为内分泌和靶向治疗效果不佳提供了理论依据。Pogue-Geile等[29]的NSABPB-31试验，通过建立预测模型分析应用曲妥珠单抗的获益情况，组织学HER-2阴性患者应用曲妥珠单抗辅助治疗后，达到良好的临床获益；而大约10%的组织学HER-2阳性患者应用曲妥珠单抗辅助治疗却是无效的。Agelaki等[30]应用靶向药物拉帕替尼能够有效治疗CTC-HER-2阳性的MBC患者，而与原发肿瘤HER-2表达状态无关，意味着在靶向治疗过程中，监测CTC的分子特征变化是可行的。那么，是否可以进行组织学和CTC水平的HER-2联合检测，对HER-2阳性者行靶向治疗的同时进行疗效的监测，从而改善乳腺癌患者的生存，有待进一步深入研究。

4 展望

1889年，Paget[31]提出了“种子与土壤”学说，强调癌细胞与机体微环境之间的关系。CTC的异质性转录使其表达不同的分子表型，表型之一的肿瘤干细胞却具有自我生长、免疫逃避、合成、耐药以及转移的特性，而在肿瘤的起源、发生、发展、浸润和转移中的作用也不同，分析CTC分子表型和基因特点比单纯检测CTC可以提供更多的临床预后信息[32]。最新研究显示，近40年来＜2cm的浸润性乳腺癌或原位癌的发病率由36%增长到68%[33]，早期发现和及时有效的治疗才是乳腺癌患者获得DFS和OS的根本方法。因此提高乳腺癌检测方法的灵敏度和制定统一的阳性值标准是亟待解决的问题。分子分型对乳腺癌的重新划分，使TNBC成为目前治疗最棘手的亚型，而其本身又是由不同亚型组成，是否可以从CTC分子特性中寻找治疗TNBC的治疗方法，有待进一步深入研究。个体化治疗、精准医学目标的实现与精确的诊疗密不可分，相信随着对CTC特性的深入研究和CTC检测技术的不断发展，CTC检测在乳腺癌诊疗中将发挥更大的作用。

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