皮肤外用制剂生物利用度及生物等效性研究进展

吴黎莉 陈 沄

皮肤靶部位药物浓度的动态变化过程对皮肤外用制剂的有效性和安全性评价具有重要价值。目前FDA对皮肤外用制剂的生物利用度要求取决于制剂的药理学分类。除了糖皮质激素类建议采用血管收缩测定法外，其他皮肤外用制剂的生物等效性评价还主要通过仿制药和创新药的临床对比试验进行，往往需要数百名参与者，既费时且费用昂贵。其他研究方法如胶带粘贴法、皮肤微透析、开流微量灌注及体外研究方法等的研究与应用日益广泛，有望成为皮肤外用制剂生物利用度和生物度研究的可行性手段。

1 FDA 认可的生物等效性研究方法

1.1 临床终点生物等效性研究 是目前评价局部用药品的生物等效性的最为常用的方法。该方法是根据在患者中证明安全性和有效性等效，确定两种制剂生物等效。临床终点生物等效性研究使用美国FDA推荐的药品专属性指标。如果参比药品标签上有多种适应症，那么通常将对药物局部递药最为敏感的适应症作为首选。

1.2 McKenzie-Stoughton血管收缩测定法(Vasoconstrictor Assay, VCA) 也被称为人体苍白斑试验(human skin blanching assay, HSBA)，是目前FDA认可的唯一的体内药效学方法[1]。该方法仅限于糖皮质激素类药物，其原理是基于局部外用糖皮质激素药物后，皮肤微血管收缩，产生可见的苍白反应，其程度直接与药物的临床疗效相关。苍白程度可以通过比色计、数字图像分析以及肉眼观察等方法进行测量。由于比色计测量的可靠性和重现性，目前管理部门将其作为首选。1995年，美国FDA发布了《行业指南：皮肤外用皮质类固醇：体内生物等效性》[2]。

Greive等[3]采用VCA法考察了受试制剂0.1%糠酸莫米松水凝胶相对于参比制剂0.1%糠酸莫米松洗液的生物等效性。90名健康受试者(男女兼有)于前臂屈侧局部外用受试制剂和参比制剂(5 mg/cm2)30 min后去除药物，等待30 min后采用比色计测量去除药物后0, 2, 4, 6, 19, 24 h皮肤的血管收缩反应，比较两制剂效应曲线下面积(AUEC0-24)，结果表明两制剂生物等效。

Krishna等[4]考察了改进后的具有乳化体系的糠酸莫米松乳膏多次给药后的局部安全性和耐受性，并采用VCA法评价其单次给药后相对于已上市的糠酸莫米松乳膏的生物等效性。结果表明42名健康受试者上背部连续给药21天，新乳膏及其基质均无皮肤刺激性反应。105名健康受试者前臂屈侧局部外用受试和参比制剂后效应曲线下面积比值为112.91%，范围为105.55%～120.87%，两制剂生物等效。

2 其他研究方法

2.1 胶带粘贴法(Tape stripping method) 也被称为皮肤药代动力学方法(Dermatopharmacokinetic method, DPK)，是在局部用药及去除药物后的特定时间内，采用胶带连续剥离角质层，从而获得药物在角质层中的浓度数据[5-7]。该方法假设：1)角质层是药物局部吸收的限速屏障；2)角质层中药物浓度与其下的表皮层中的药物浓度直接相关[7,8]。该方法相对无痛、基本无创，被广泛用于与角质层相关的研究中。

1998年，美国FDA发布了指南草案《皮肤局部用药品新药申请和仿制药品申请的体内生物利用度、生物等效性、体外释放和相关研究》[9]。在该指南中，DPK方法被推荐用于皮肤局部用药品的生物等效性评价。该指南于2002年5月基于以下原因被撤回[6,10,11]：1)DPK方法不足以评价所有皮肤外用制剂的生物等效性，因为它们可以用来治疗不同皮肤部位的多种疾病。对于非角质层作用靶位以及渗透机制不同于角质层扩散(如滤泡吸收等)的药物，并不能反映其治疗有效性；并且DPK方法不适用于疾病状态;2)方法在不同实验室之间的重现性问题。

由于人体皮肤角质层厚度存在个体差异，因此按照FDA指南草案中的规定，对不同受试者采用相同层数胶带，粘取的角质层总量并不一致，从而带来试验数据的变异。为了降低个体间及个体内变异(不同部位)，提高方法的重现性，研究者对DPK方法进行了诸多改进，如采用经皮水分散失值(Transepidermal water loss, TEWL)来反映角质层去除程度等。

Herkenne等[8]的研究中，10名健康受试者前臂屈侧皮肤局部外用布洛芬溶液剂，于不同时间点采集用药部位角质层样本，称重，测定每层胶带中药物浓度。于用药部位相邻皮肤处，以粘性胶带采集空白角质层样本，称重，同时测定TEWL值，根据Fick 第一定律，计算角质层厚度L，获得药物浓度在角质层中相对位置(x/L)的分布曲线。然后根据Fick第二定律，采用软件拟合得到反映药物经皮扩散的速度和程度的重要参数：扩散系数D/L2和分配系数K，从而计算药物透皮吸收的迟滞时间Tlag(=L2/6D)及达稳态时间Tss(=2.7Tlag)，预测药物透皮吸收的量随给药时间的变化情况。N'Dri-Stempfer等[12]采用改进的DPK方法评价3种1%硝酸益康唑乳膏的人体生物等效性，除了采用TEWL值来反映角质层去除程度，采取新的清洗步骤和将所有胶带都纳入分析以外，该方法仅在吸收相和消除相各选取一个时间点进行生物等效性评价，每个时间点采用双样本。改进后的方法可以减少生物等效性评价所需受试者例数及给药部位，并且可以降低不同实验室数据之间的变异。

García Ortiz[13]和Miron[14]通过对比研究发现，胶带粘贴法仅适用于作用靶位为角质层本身的局部外用药物，如抗真菌药，防晒品及抗菌剂等。而对于作用靶位为表皮-真皮的皮肤外用制剂，胶带粘贴法是无能为力和应用受限的。

2.2 皮肤微透析(dermal microdialysis, DMD) 是一种微创的在体取样技术，通常是在选定部位植入与皮肤表面平行的具有透析作用的探针，透析液持续流动，保持浓度梯度，定时收集透析液，结合适当的分析设备和技术，实现内源性和外源性小分子或亲水性化合物在真皮细胞间液和皮下组织内游离浓度的动态检测[15,16]。

最早的皮肤微透析研究见于1991年Anderson等关于乙醇的人体透皮吸收的报道。近年来，随着其方法学[16,17]的不断发展，该技术已广泛用于皮肤外用制剂评价、离子电渗药物转运、皮肤屏障中转运蛋白相互作用及疾病相关的生物标志物等方面的研究[16]。

与其他方法相比，DMD具有活体、原位采样，实时、在线检测等突出特点。DMD可获得靶部位中药物及其代谢物的游离浓度，给出药物局部转运的直接相关数据，是获得以真皮为作用靶位的皮肤外用制剂的在体研究数据的首选方法[15]。可用于正常皮肤、屏障功能不全皮肤[18,19]及皮损皮肤[20]。还可以用于研究更深层次皮肤中药物浓度。美国FDA及欧盟已批准MD探针用于人体。

然而，MD技术对于水溶性较低(辛醇-水分配系数对数>2.5～3)以及易与蛋白结合的物质，往往需要对灌流液进行优化以改善探针的低回收率[21-23]，使其应用受到限制。而且在如何提高方法的重现性、探针植入与由此引起的组织损伤之间的确切关系，体外渗透研究方法与DMD方法所获数据之间的相关性以及如何更简便地适用于脂溶性药物的研究等方面仍需进行深入研究。

该方法与DPK法相比具有较大的侵入性。对于脂溶性较高，以及预期在角质层起效的物质，其他方法(如DPK法)往往更为适用。

2.3 开流微量灌注(open flow microperfusion, OFM) 是近年来发展起来的一种侵入性较小、持续、无膜的采样技术。OFM是对微透析的一种改进，它是用肉眼可见的钢网取代微透析探针的透析膜。与微透析系统相比，由于该系统在组织间液中的交换是开放的，对内源性和外源性物质进行采样时可不受其分子量、蛋白结合率以及脂溶性的限制，应用范围更为广泛[24]。目前经过欧洲CE认证的皮肤开流微量灌注(dermal OFM, dOFM)装置采用线性设计的探针、0.5 mm的插入针和可穿戴的采用推挽模式的泵。探针的植入深度可以通过高频超声波扫描定位(50 MHz)。

Bodenlenz等[25]采用dOFM方法进行了脂溶性抗银屑病药物BCT194的皮肤药代动力学/药效学研究。9例银屑病患者分别在皮损和非皮损部位连续8天，每天1次，局部外用0.5% BCT194乳膏，于第1天和第8天分别采集各用药部位的皮肤间液样品，连续采集25小时。LC-MS/MS法测定样品中BCT194浓度，同时采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测样品中肿瘤坏死因子(TNFa)水平。结果表明dOFM克服了微透析方法学的限制，适用于皮肤外用制剂的PK/PD研究。

Bodenlenz等[26]的最新研究考察了dOFM技术在5%阿昔洛韦乳膏的生物利用度和生物等效性研究中的准确性、灵敏性和重现性。20名健康受试者每人于六个部位随机局部外用阿昔洛韦乳膏受试制剂(T)和参比制剂(R)，每个部位植入两根探针，采样至36 h，测定真皮内阿昔洛韦浓度动态变化过程，进行生物等效性评价。结果显示，阳性对照组(R/R)可以得出稳定重现的等效性结论；而阴性对照组(T/R)则显示两制剂不等效。该研究结果表明dOFM可以灵敏、重现的表征5%阿昔洛韦乳膏在真皮中的生物利用度，并作为其生物等效性评价的一种方法。

2.4 体外研究方法 体外终点生物等效性研究取决于配方简单的局部用药品的体外特性。近来，美国FDA 已经开始认可对简单的外用药品配方(非溶液剂)开展体外研究。开展的研究包括体外流变试验(测试制剂的理化性质)和体外释放度试验(In Vitro Release Test, IVRT)。

虽然局部外用制剂中活性成份的体外释放度试验可表征成品局部制剂性能特征，作为质量控制的程序，并用于放大和批准后变更的理由，但权威部门通常不接受其作为生物等效性研究的方法。直到2013年美国FDA 公布了关于阿昔洛韦软膏的研究草案。该指南规定，采用体外方法进行阿昔洛韦软膏的生物等效性研究必须满足以下条件：受试制剂和指定参比制剂具有相同的定性和定量组成(Q1/Q2)及物理化学性质(Q3)，并且两种制剂的体外药物释放速率试验结果一致。

垂直扩散池被认为是测定局部外用制剂中有效成分从制剂中释放速率并预测药物生物利用度/生物等效性的最有效的体外模型。美国FDA目前认可采用合成膜进行药物体外释放度研究。由于合成膜资源充足，并且可以消除离体皮肤因为年龄、种族、性别、解剖部位不同而带来的差异，从而可以获得重现性较高的药物体外渗透数据。Nallagundla等[27]采用垂直扩散池及多种合成膜比较了南非和印度市场上四种阿昔洛韦普通乳膏相对于新制剂Zovirax乳膏的体外释放速率。结果表明其90%置信区间均在75%～133%范围内。

该方法能否适用于除阿昔洛韦以外的其他具有Q1/Q2/Q3一致性的半固体制剂的生物等效性评价还需要进一步的研究。

3 结语

皮肤外用制剂的生物利用度和生物等效性研究相对复杂，并没有一种唯一的、标准的方法能够对其做出全面的评价，国际监管机构对于各种方法的接受度不一[11]。根据药物理化性质和作用靶部位选择合适的研究方法，或将几种方法联合应用可能会得到皮肤外用制剂在作用靶部位吸收、分布及代谢方面的更为全面的数据。