甘蔗启动子研究进展

张锦 ，刘新龙 ，李纯佳 ，刘洪博 ，朱建荣 ，李旭娟 *

（1.云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，云南开远661699；2.红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661199）

高等植物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程[1]。基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，DNA序列是遗传信息的储存者，它通过自主复制得到永久存在，其生物功能是以蛋白质的形式表达出来，其中转录水平上的调控是最关键的环节。启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性[2]，并与反式作用因子或环境中的物理、化学、生物或非生物等因素互作来控制特定基因的定时、定位、定量表达，是基因转录水平上一个重要的调控元件。另外，在基因工程研究中，启动子的选择和使用对外源基因的表达水平影响极大，是决定外源基因转录效率并决定基因表达模式与表达强度的关键因素。

甘蔗（Saccharum spp.）属于单子叶禾本科C4光合作物，是世界上最重要的糖料作物。目前，我国食糖总产仅次于巴西和印度，其中蔗糖是我国食糖的主要来源，占食糖总量的92%以上[3]。同时，甘蔗也可作为生产绿色能源乙醇[4]、天然药用化合物[5]和一些生物聚合物[6]的原料，因而对于缓解能源问题具有重要的实际意义。但甘蔗为异源多倍体植物，遗传背景和基因变异复杂，其性状是多基因共同作用的结果，前人研究表明甘蔗基因启动子序列富含丰富的变异，对基因的表达调控和功能作为起关键作用。基于此，回顾甘蔗糖分、抗性和分蘖相关基因启动子序列的克隆和活性研究，对于了解甘蔗启动子的结构和调控特点具有重要的指导意义，同时也为运用启动子序列操纵甘蔗相关基因的表达和功能行使，进而为改良品种性状提供重要参考。

1 糖分相关基因启动子的克隆、活性和功能分析

长期以来，甘蔗中最基本的生产功能由糖分代谢与糖转运相关基因组成，一直是研究者重点挖掘和功能研究的对象[7]。甘蔗糖代谢是一个复杂的过程，涉及多种酶的控制，如蔗糖磷酸合成酶（SPS）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）、蔗糖合成酶（SS）、转化酶（INV）、果糖激酶（FRK）和磷酸果糖激酶（PFK）等，其中UGPase处于糖代谢中交叉点的位置，它不但可作为葡萄糖基供体，参与生物体内多种寡糖及多糖的合成，如海藻糖、蔗糖、淀粉、维生素的生物合成，而且还是合成其他核苷二磷酸单糖，如尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸木糖等的前体，所以在糖代谢中起着举足轻重的作用，其基因的表达调控机制较为复杂[8]。邱思等[9]从甘蔗品种福农95-1702中克隆了UGPase基因的5’侧翼启动子序列，并预测含有TATA-box、CAAT-box、大量光响应元件和组织发育有关元件；叶冰莹等[10]将该基因不同长度的启动子序列与GUS报告基因连接构建表达载体，分析结果表明所克隆的UGPase基因启动子序列不具有活性，启动子无活性可能是由于转化的假阳性，也可能是此基因的表达存在组织特异性或存在假基因的现象。

转化酶与蔗糖积累密切相关，在蔗糖的转运、贮藏和分配中起重要作用，是调节蔗糖代谢的关键酶之一，分为 3 种类型 ：（1）可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase，SAI）；（2）可溶性中性或碱性转化酶（neutral or alkaline invertase）；（3）细胞壁结合的酸性转化酶（cell wall-bound invertase，CWI）[11]。 牛俊奇等从甘蔗品种桂糖（GT28）中分别克隆到甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因5’侧翼部分启动子序列[12]和中性/碱性转化酶基因（SoNIN1）5’侧翼启动子序列[13]；软件分析：SoSAI1基因启动子含有多个CAAT-box、TATA-box等基本作用元件、胚乳特异表达顺式作用元件（Skn-1 motif）和参与干旱诱导的MYB结合位点，现只获得该基因启动子的部分序列，要进行启动子活性和功能分析，还需进一步实验以获得更长的5’侧翼序列。SoNIN1基因启动子序列长1174bp，除了含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件，还含有干旱诱导的MYB结合位点，脱落酸响应元件（motif IIb）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif）和赤霉素响应元件（P-box）以及光应答等顺式作用元件，进一步研究表明该基因受PEG胁迫和NaCl诱导下能在甘蔗根和叶中表达。

蔗糖合成酶（SS）是调控蔗糖代谢的关键酶，它催化蔗糖进入各种代谢途径，雷美华等[14]从甘蔗品种福农95-1702中克隆到该基因1.9kb的上游启动子序列，软件分析表明该序列具有真核生物启动子的一般特征，还具有糖诱导SURE元件，后期研究希望能找到转录该基因的重要调控区域及关键元件，并进行功能研究及活性验证，为甘蔗蔗糖合成酶基因的启动子及内含子研究提供新的资料，并从转录水平上阐明甘蔗蔗糖合成酶的表达调控机制提供理论依据。

蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成途径的关键限速酶，其活性能影响蔗糖合成能力和光合中间产物向蔗糖和淀粉途径的分配，并调控蔗糖的积累、参与纤维细胞壁合成与胁迫应答等。周平等[15]克隆了甘蔗SPSIII的基因组DNA片段及其5’侧翼序列，分析表明该启动子含有TATA启动盒和一些与光响应相关的ACE、ATCT-motif、AE-box元件，芽组织特异性元件as-2-box和分生组织特异性元件GCN4-motif、CAT-box等，通过启动子缺失实验遗传转化甘蔗愈伤组织观测瞬时表达，证实了甘蔗SPSIII基因的5’侧翼序列具有启动子活性，可以驱动报告基因在愈伤分生组织中的表达。高玉娜等[16]将其课题组构建的含有SPSIII基因5’侧翼序列的缺失表达载体遗传转化烟草获得转基因植物研究表明，在叶片、茎、根颈、花托、粤片、花瓣、花药、花柱以及幼苗叶片中表达，表明SPSIII基因启动子序列具有启动子活性，且不同片段具有不同组织特异性。张积森等[17]通过酵母单杂交的方法，筛选潜在SPSIII基因启动子光响应元件ATCT-motif和分生组织特异性元件CAT-box调控元件互作的转录因子，最终筛选得到14个与SPSIII 5’侧翼的光响应元件和分生组织特异性元件互作的非重复序列，为分离调控SPSIII基因表达的转录因子提供了候选基因。

蔗糖转运蛋白（sucrose transporter，SUT）负责蔗糖的跨膜运输，在韧皮部介导的源-库蔗糖运输，以及库组织的蔗糖供给中起关键作用[18]。吴自明等[19]从甘蔗品种福农28中克隆出甘蔗蔗糖转运蛋白基因SUT4的启动子序列，结构分析表明其具有真核生物启动子的一般特征，如TATA-box和CART-box等特征元件，此外，还推测出该启动子区域含有一些与MYB结合位点、脱落酸响应元件ABRE、光照、低温响应元件LTR响应等有关的顺式作用元件，它们在某种程度上影响甘蔗SUT4基因的转录，其活性还有待验证。郭婷等[20]从甘蔗品种新台糖22号（ROC22）中克隆出甘蔗单糖转运蛋白基因（ShPST2a），细胞亚定位预测为一种膜蛋白；蔡文伟等[21]克隆了该基因5’上游1968bp的启动子序列，生物信息学分析预测PST2a基因启动子序列具有多个启动子的基本转录元件TATA-box、CAAT-box、脱落酸和干旱应答元件ABRE、厌氧应答元件ARE、植物胚乳形成相关元件Skn1-motif、维管特异表达元件ACIII-element等元件，并构建了表达载体在甘蔗茎部和叶片上进行瞬时表达，分析结果发现该启动子是一个驱动能力较35 S启动子更强的茎秆特异性启动子；马滋然等[22]也克隆了该基因的启动子pPST2a，并构建了一系列的缺失表达载体遗传转化甘蔗愈伤组织后获得一批转化植株，进行根、茎、叶、叶芽、叶鞘、5个部位的GUS基因表达的检测，通过GUS组织化学染色定位法证明该启动子具有甘蔗根特异表达的特性。

2 逆境相关基因启动子活性及功能分析进展

甘蔗是典型的亚热带作物，由于近年全球气候的多变性以及甘蔗种植向旱坡和山区发展，干旱、盐碱、低温等非生物胁迫因子的影响已成为制约甘蔗产量和品质的关键因素，其中干旱对甘蔗伤害最大。研究表明：土壤干旱胁迫导致甘蔗自由水和叶绿素含量急剧下降、光合作用效率降低[23]，从而影响甘蔗生长发育和糖分的运输累积，造成甘蔗产量大量减少[24]。

逆境相关蛋白家族（Stress-associated proteins，SAPs）中的A20/AN1型锌指蛋白与非生物胁迫应答相关，是提高植物的抗逆能力和保证作物产量最有潜力的基因[25]。李晓君等[26]从甘蔗品种 （拔地拉）中克隆了ShSAP1基因1243 bp的启动子序列，生物信息学分析表明该序列具有启动子的核心元件，干旱等胁迫相关的应答元件、MYB/MYC转录因子识别与结合元件、组织特异性相关元件，说明ShSAP1的启动子可能具有逆境应答及组织特异表特性，活性和功能还需要进一步验证。Prabu G等[27]从甘蔗中分离出与胁迫相关转录因子MYB基因（ScMYBAS1）的5’侧翼启动子序列，并进行了缺失分析，确定了启动子的核心区域在转录起点至-303bp，还证明了该启动子受干旱、盐、低温、伤害、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）诱导。

逆境（胁迫）是影响植物正常生长发育并造成生物大量减产的原因，植物应答逆境胁迫过程是一个涉及多基因、多信号转导和多基因表达产物的复杂过程。渗透调节机制和ABA信号转导途径在植物的抗逆生长过程中发挥着重要作用。尽管现在已经从甘蔗中克隆了许多能在干旱、低温、高盐和氧化胁迫下诱导表达的关键调控酶基因，如：甘蔗独脚金内酯生物合成基因（ScCCD8）[28]、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（SsCIPK23）[29]、蔗糖-1-果糖基转移酶基因（1-SST）[30]、甘蔗 ABA 生物合成关键酶基因（SoNCED）[31]、蔗糖非酵解型蛋白激酶基因（SoSnRK2.1）[32]和很多非生物胁迫转录因子如：NAC[33]、MYB[34]、锌指蛋白 Sc-zf[35]等基因，但关于这些基因的启动子研究的较少，鉴于启动子在转基因育种中具有重要地位，应多挖掘关于逆境胁迫诱导和组织特异型启动子，提高抗逆基因的表达效率。

3 甘蔗分蘖性状启动子研究进展

分蘖（分枝）是禾谷类作物和其他许多单子叶植物生长发育过程中最重要的农艺性状之一，是影响农作物穗数或茎数以及形态建成进而影响其产量的重要性状因子[36]。在甘蔗生产中，有效分蘖茎的多少和大小直接决定了甘蔗产量的高低。MOC1是我国科学家李家洋等克隆到的一个控制水稻分蘖的关键基因，该基因可编码一个属于GRAS家族的转录因子，功能是促进分蘖和腋芽生长[37]。李旭娟等[38]从ROC22中克隆了MOC1的同源基因，并命名为ScMOC1，利用实时荧光定量PCR分析，结果显示ScMOC1在分蘖期的ROC22中的表达具有组织特异性，在茎尖生长点处表达量最高；在腋芽形成发育过程中该基因表达总体呈现出 “升-降-升-降”的趋势，说明ScMOC1基因可能在甘蔗腋芽形成发育阶段中发挥作用。目前，李旭娟等已经克隆出该基因5’端上游2.8kb的调控序列（待发表），下一步将进行启动子活性验证和功能分析。

李旭娟等从ROC22中克隆了ScKN1[39]、ScTB1[40]和ScTAD1[41]等多个与分蘖性状相关的基因；吕爱丽等[42]也在甘蔗中克隆了能编码有效控制分蘖的水解酯酶（ScHTD2）基因。这些基因对控制甘蔗分蘖性状的发生起着重要作用，挖掘和利用这些基因启动子序列对于研究其调控机理和育种具有重要意义。目前，相对于水稻、拟南芥等植物，甘蔗分蘖性状的研究较滞后[43]。但由于分蘖基因是影响甘蔗产量的重要因素，且分子育种技术在育种方面有较多优势，因此对甘蔗分蘖性状相关基因启动子的研究是目前乃至今后重要的发展方向。

4 其他启动子研究进展

乙烯（Ethylene）是调控植物生长发育、成熟衰老的重要激素[44]，通过诱导相关基因表达从而调控植物的生长发育和生物及非生物胁迫的应答[45]。目前，已经从拟南芥中克隆了多个乙烯信号转导途径中的基因，发现了多个乙烯受体蛋白，但对受体基因调控机理尚未清楚[46]。黄静丽等[47]从ROC22基因组DNA中克隆甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列，生物信息学预测该序列具有多个基本元件TATA-box、CAAT-box、光响应元件、干旱诱导MYB结合位点（MBS）、SA、MeJA、Skn1-motif等响应元件，推测Sc-ERS基因的表达可能受生理周期、激素、干旱、光照等因素调控。甘蔗乙烯受体Sc-ERS基因启动子序列的获得，为进一步从转录水平上研究甘蔗乙烯受体基因调控表达机理以及运用该启动子调控甘蔗生长和蔗糖积累奠定基础。

甘蔗茎部是储存合成产物的主要器官，茎部特异性启动子的挖掘和利用对于甘蔗作为生物反应器的研究具有重要意义。国内已经克隆到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a的启动子，并通过瞬时表达证明该启动子具有茎秆特异性[20]；在国外，Abraha T G[48]从甘蔗基因组中分离了具有茎部特异性基因c22-a的启动子序列，并命名为DPB，实验证明该启动子只在甘蔗茎秆薄壁细胞中表达。

5 展望

甘蔗作为世界上重要的糖料作物和经济作物，通过基因工程技术来提高甘蔗糖分、产量、抗逆性是甘蔗糖业的主要发展方向。在目前甘蔗启动子的育种和运用中，组成型启动子如CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子、玉米泛素（Ubiquitin）启动子、水稻（Actin）启动子和人造（Emu）启动子得到了广泛运用。但在育种方面最重要的限制因素之一是缺乏能稳定表达的组织特异型启动子，所以挖掘甘蔗优异性状编码基因的同时还应加强诱导型和组织特异型启动子的开发利用，从而更好地为甘蔗育种奠定基础。

[1]张春晓，王文棋，蒋湘宁，等.植物基因启动子研究进展[J].遗传学报，2004，31（12）：1455-1464.

[2]朱玉贤.现代分子生物学（第4版）[M].北京：高等教育出版社，2013.

[3]李明，田洪春，黄智刚.我国甘蔗产业发展现状研究[J].中国糖料，2017，39（1）：67-70.

[4]黄春全.石油、甘蔗乙醇与中国食糖市场[D].北京：中国农业大学，2014.

[5]任志强，刘惠民，李润植，等.转基因植物作为生物反应器在疫苗生产中的应用[J].中国生物工程杂志，2003，23（6）：31-35.

[6]Cardoso A M,Da S C,As D P S,et al.Polyhydroxybutyrate production by a sugarcane growth promoter bacterium[J].Bmc Proceedings,2014,8(4):1-2.

[7]朱琳.甘蔗中蔗糖代谢途径关键基因和糖转运蛋白的系统发育研究[D].长春：吉林大学，2013.

[8]祁超.Apocynaceae系细胞尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的纯化和表征[J].中国科学院大学学报，2004，21（3）：345-351.

[9]邱思，叶冰莹，陈由强，等.甘蔗UGPase DNA及其5’侧翼序列的克隆与序列分析[J].甘蔗糖业，2011（4）：1-4.

[10]叶冰莹，王婷，何文锦，等.甘蔗 UGPase5'侧翼序列克隆及缺失表达分析[J].植物研究，2014，34（1）：62-67.

[11]潘秋红，张大鹏.植物转化酶的种类、特性与功能[J].植物生理学报，2004，40（3）：275-280.

[12]牛俊奇，王爱勤，黄静丽，等.甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析[J].中国农业科学，2013，46（24）：5248-5260.

[13]牛俊奇，王爱勤，黄静丽，等.甘蔗中性/碱性转化酶基因（SoNIN1）的克隆和表达分析[J].作物学报，2014，40（2）：253-263.

[14]雷美华，叶冰莹，王冰梅，等.甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆[J].应用与环境生物学报，2008，14（2）：177-179.

[15]周平，何炜，金光，等.甘蔗SPSIII基因组DNA及5’侧翼序列的克隆与分析[J].农业生物技术学报，2014，22（1）：1-9.

[16]高玉娜，林荣华，周平，叶冰莹，等.甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因启动子遗传转化烟草的研究[J].福建师大学报：自然科学版，2010，26（1）：100-102.

[17]张积森，郑月霞，邹丽娟，叶冰莹，等.酵母单杂交方法初步鉴定甘蔗SPSIII启动子区域调控序列[J].农业生物技术学报，2012，20（11）：1282-1290.

[18]戚继艳，阳江华，唐朝荣.植物蔗糖转运蛋白的基因与功能[J].植物学报，2007，24（4）：532-543.

[19]吴自明，江安庆，张积森，等.甘蔗ShSUT4基因及其5'侧翼序列的克隆与序列分析[J].亚热带农业研究，2012，8（2）：126-130.

[20]郭婷，赵婷婷，王俊刚，等.甘蔗单糖转运蛋白基因ShPST2a克隆及亚细胞定位[J].热带作物学报，2013，34（3）：429-432.

[21]蔡文伟，王正鹏，张树珍，等.甘蔗茎杆特异表达基因启动子的克隆及初步分析[J].中国生物工程杂志，2009，29（8）：92-96.

[22]马滋蔓.甘蔗己糖转运蛋白基因启动子pPST2a的功能研究[D].海口：海南大学，2010.

[23]陈如凯，张木清，陆裔波.干旱胁迫对甘蔗生理影响的研究[J].亚热带农业研究，1995(gz)：1-6.

[24]Jangpromma N,Thammasirirak S,Jaisil P,et al.Effects of drought and recovery from drought stress on above ground and root growth,and water use efficiency in sugarcane(Saccharum officinarum L.)[J].Australian Journal of Crop Science,2012,6(8):1298-1304.

[25]Giri J,Dansana PK,Kothari K S,et al.SAPs as novel regulators of abiotic stress response in plants[J].Bioessays News&Reviews in Molecular Cellular&Developmental Biology,2013,35(7):639-648.

[26]李晓君，武媛丽，张焱珍，等.甘蔗ShSAP1基因的启动子克隆与序列分析[J].中国农学通报，2014，30（12）：272-278.

[27]Prabu G,Prasad D T.Functional characterization of sugarcane MYB transcription factor gene promoter(PScMYBAS1)in response to abiotic stresses and hormones[J].Plant Cell Reports,2012,31(4):661-669.

[28]吴转娣，刘新龙，刘家勇，等.甘蔗独脚金内酯生物合成基因ScCCD8的克隆与表达分析[J].中国农业科学，2016，49（14）：2662-2674.

[29]凌秋平，曾巧英，胡斐，等.甘蔗CIPK23基因克隆及对低钾、干旱、盐胁迫的响应[J].分子植物育种，2015（6）：1329-1335.

[30]武媛丽.转蔗糖：蔗糖-1-果糖基转移酶基因甘蔗的抗旱性研究[D].海口：海南大学，2011.

[31]谭秦亮，潘成列，杨丽涛，等.甘蔗ABA生物合成关键酶SoNCED基因克隆及表达分析[J].南方农业学报，2017，48（1）：1-8.

[32]谭秦亮，李长宁，杨丽涛，等.甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析[J].作物学报，2013，39（12）：2162-2170.

[33]李伟，韩蕾，钱永强，等.非生物逆境胁迫相关NAC转录因子的生物信息学分析[J].西北植物学报，2012，32（3）：454-464.

[34]李国印.甘蔗MYB转录因子生物信息学分析、基因克隆与表达[D].福州：福建农林大学，2011.

[35]刘金仙，阙友雄，郑益凤，等.甘蔗锌指蛋白基因的克隆和表达分析[J].农业生物技术学报，2009，17（4）：707-712.

[36]Wang Y,Li J.Branching in rice[J].Curr Opin Plant Biol.,2011,14(1):94-99.

[37]方德声.克隆水稻分蘖的主控基因 MOC1[J].科学：上海，2003，55（4）：11.

[38]李旭娟，李纯佳，徐超华，等.甘蔗 MOC1 基因（ScMOC1）的克隆与表达分析[J].植物遗传资源学报，2017，18（4）：734－736.

[39]李旭娟，刘洪博，林秀琴，等.甘蔗KNOX基因（Sckn1）的电子克隆及生物信息学分析[J].基因组学与应用生物学，2015，4（1）：136-142.

[40]李旭娟，林秀琴，刘洪博，等.甘蔗TB1基因的克隆与生物信息学分析[J].热带作物学报，2015，36（11）：1978-1985.

[41]李旭娟，字秋艳，李纯佳，等.甘蔗 TAD1（ScTAD1）的克隆与表达分析[J].中国农业科学，2017（9）：1571-1581.

[42]吕爱丽，李旭娟，刘洪博，等.甘蔗ScHTD2基因的克隆及生物信息学分析[J].热带作物学报，2016，37（6）：1133-1140.

[43]吕爱丽，吴才文，刘新龙，等.甘蔗分蘖性状研究进展[J].中国糖料，2016，38（2）：60-62.

[44]Woodson W R,Lawton K A.Ethylene-induced gene expression in carnation petals:relationship to autocatalytic ethylene production and senescence[J].Plant Physiology,1988,87(2):498-503.

[45]Ohmetakagi M,Suzuki K,Shinshi H.Regulation of ethylene-induced transcription of defense genes[J].Plant&Cell Physiology,2000,41(11):1187-1192.

[46]刘元风，李晓方，李玲.乙烯受体与信号转导成员的研究进展[J].生命科学研究，2003（s1）：73-77.

[47]黄静丽，牛俊奇，朱惠，等.甘蔗乙烯受体Sc-ERS启动子的克隆与序列分析[J].南方农业学报，2013，44（5）：722-729.

[48]Abraha T G.Isolation and characterisation of a culm-specific promoter element from sugarcane[D].Stellenbosch University of Stellenbosch,2005.