甘油二酯酰激酶ε相关的非典型溶血尿毒综合征发病机制研究进展

汪洪菊 韩飞

溶血尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS）属于血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy，TMA），其特点是血管内皮细胞受损、微血管内血栓形成，随之引起靶器官功能障碍、血小板过度消耗致血小板减少性紫癜及非免疫性微血管病性溶血性贫血[1-3]。肾脏是HUS的主要靶器官，神经系统、肺、心脏、胰腺等均可受累[2]。根据病因，HUS 可分为：（1）STEC-HUS：约占 HUS患者的90%，主要发生在学龄前儿童，由产类志贺毒素的大肠埃希菌（STEC）感染引起，血清型O157：H7最常见。潜伏期4～7d，急性起病，表现为呕吐、腹泻、腹痛，血性腹泻是其显著特点，2～10d后表现为HUS的典型三联征（微血管病性溶血性贫血、血小板减少，急性肾衰竭），预后较好；（2）肺炎链球菌相关性HUS：因感染产N-神经氨酸苷酶的肺炎链球菌而发病，2岁以下的儿童是易感人群，在儿童HUS中约占5%。可引起致命性的肺炎、脑膜炎、败血症，预后不佳，急性期病死率25%[4]；（3）非典型 HUS（aHUS）：约占 HUS 患者的 10%[5]，可发生在任何年龄，复发率高，预后差，约50%患者发展为终末期肾病（ESRD），25%患者死亡[6-7]。aHUS受遗传因素和环境因素的双重影响。遗传性或获得性补体旁路途径无限制激活在aHUS发病中起主要作用。妊娠、感染、药物、恶性高血压、器官移植或自身免疫性疾病均可使遗传易感个体补体级联反应激活致aHUS发病[8]。补体级联系统中相关的突变基因共有9个：补体H（CFH）、补体 I（CFI）、膜辅助蛋白（MCP）、B 因子（CFB）、C3、血酸调节素（THBD）、补体 H 相关基因（CFHR1-3）[6,9]。此外，抗CFH抗体产生是获得性aHUS发病的原因。以上异常使补体旁路途径调节失控、补体级联激活、膜攻击复合物形成，导致内皮细胞功能受损而起病。上述补体出现基因突变、基因组拷贝数变异、基因多态性等致补体调节异常是aHUS的主要遗传机制[10]。aHUS呈常染色体显性遗传，为不完全外显性，约50%的突变携带者表现外显性[11-12]。其外显率随突变基因不同而有差异，CFH、MCP突变常表现出高度外显性[13]。但是，仍约50%的aHUS患者未发现继发性因素及补体异常[6]，需进一步增加对其病因及致病机制的认识和了解。

2013年，Lemaire等[14]通过对大量1岁以下的aHUS患儿进行基因测序，发现甘油二酯酰激酶ε（diacylglycerol kinase ε，DGKE）基因隐性突变是一种新型aHUS的重要发病机制。该aHUS特点是：发病年龄＜1岁，伴有蛋白尿甚至是肾病范围蛋白尿，无致病性补体基因突变[14]。Lemaire等[14]认为，DGKE基因突变是不依赖于补体旁路途径而致aHUS发病的一种独立机制；而Sánchez Chinchilla等[15]认为补体异常和DGKE突变在致aHUS发病上具有相互作用，可引起足细胞结构受损、出现肾病性蛋白尿，部分患者可同时出现补体和DGKE异常，且补体异常可控制DGKE基因突变患者的发病及对治疗的反应。本文旨在阐述上述两种机制在aHUS发生、发展中的作用。

1 补体异常与aHUS

aHUS与补体旁路途径过度激活相关。遗传性和自身免疫性异常致旁路途径无限制激活在补体介导的aHUS的关键作用已得到证实。遗传性补体旁路途径异常主要有2种类型：功能丧失突变如编码CFH、CFI、MCP等的基因[16]，这些基因发生突变后，编码的调节蛋白减少、调节功能降低，进而使CFH、CFI、MCP抑制补体激活的作用减弱，导致补体无限制激活；功能获得突变如编码C3、CFB等的基因，发生突变后可使补体旁路途径C3转化酶的生成增加，补体过度激活[3]。以上异常引起补体旁路途径的级联反应：小血管或毛细血管内皮细胞上大量C3b沉积、C3转化酶形成，产生新的C3b分子；C3b分子和C3转化酶结合形成C5转化酶，进而裂解C5分子为C5a和C5b，最终形成膜攻击复合物。这种级联反应可严重损伤血管内皮细胞功能，使其失去抗血栓作用，引起血小板激活、纤维蛋白沉积及血栓形成堵塞靶器官的微血管腔。

CFH是补体旁路途径最重要的调节蛋白，有20个短共有重复序列（SCRs）组成。N-末端SCRs1-4发挥免疫调节功能，C-末端SCRs 19-20能特异的结合在肾小球内皮细胞[17]。CFH基因突变在aHUS病例中约占20%～30%，以杂合突变为主。大部分突变患者血浆CFH水平正常，产生突变蛋白而失去调节功能。编码CFH相关蛋白基因（CFHR1-5）在染色体上和CFH基因位置毗邻，两者具有高度的序列一致性，可发生非等位的同源重组（NAHR）使调节蛋白活性降低。重组基因在aHUS患者约占 3%～5%，CFH-CFHR1、CFH-CFHR3、CFHCFHR1-CFHR3的重组基因均有病例报道[18-20]。抗CFH抗体介导的aHUS约占5%～10%，在儿童病例中约占25%～50%。约 90%的 CFH抗体患者有 CFHR1和CFHR3基因纯和缺失，导致相关蛋白缺陷。新的研究也提示，CHF抗体产生是由CFHR1基因突变或CFHR1/CFHR4基因共同缺失致CFHR1蛋白缺陷引起[21]。因此，CFHR1蛋白缺陷是导致CFH抗体产生的主要因素。

MCP是CFI裂解C3b、C4b分子的辅助因子，其基因突变约占10%～15%。约75%的MCP基因突变致MCP蛋白表达下降。CFI是一种丝氨酸蛋白酶，在辅助因子CFH、MCP的存在下，其功能是裂解C3b、C4b分子。CFI突变约占4%～10%，约50%的突变患者其蛋白分泌缺乏。C3、CFB基因功能获得突变致C3转化酶形成增加、补体激活失去限制。C3突变使C3b失去与调节蛋白结合的能力而不被降解，导致肾小球内皮细胞和血小板上C3转化酶形成增加。CFB突变致B因子表达上调、C3转化酶的稳定性和活性增加且难以被CFH降解，最终导致补体旁路途径持久性激活。THBD突变约占3%～4%，突变蛋白致C3b失活的作用减弱。

值得注意的是，约3%～12%的患者可能携带一种以上的补体突变基因（联合基因突变）[22-24]。Bresin等[8]检测了800例aHUS相关的补体突变基因发现，27例（3.4%）患者有联合基因突变，而CFH、C3或CFB单基因突变就足以诱发aHUS；25%MCP或CFI突变的患者仍合并存在2个或3个其它致病基因突变。因此，Bresin等[8]认为补体基因突变增加了aHUS的易感性，但不直接导致aHUS的发生；并且，在不完全外显性的前提下，单基因突变的aHUS其外显性低于2个基因突变的aHUS，有2例患者携带3个突变基因表现为完全外显性。单基因突变的患者，促发因素和aHUS的发病之间具有相关性[11-12，25]。

补体基因突变或抗CFH抗体引起的aHUS也可表现肾病性蛋白尿，且主要发生在儿童。1例CFH纯合子突变的aHUS儿童患者，开始给予每周1次的血浆输注治疗，能成功控制病情，但是在治疗第4年出现复发，并发展为肾病范围蛋白尿[26]。138例由抗CFH抗体引起的aHUS中，81例（59%）患者在aHUS发病时即存在肾病范围蛋白尿[27]。1例10岁携带K441R CFI突变体的aHUS患者，表现为持续的血小板减少性紫癜、贫血、肾功能衰竭和肾病范围蛋白尿。该患者对血浆治疗反应不佳，抗C5单克隆抗体治疗后，肾功能恢复、尿蛋白减少[28]。综上所述，足细胞也是补体介导aHUS的靶点，其损伤导致肾病性蛋白尿，多见于儿童aHUS患者。

2 DGKE突变与aHUS

Lemaire等[14]于2013年首次报道DGKE纯和子或复合杂合子突变可引起一种特殊类型aHUS，且患者均不伴有补体成分异常，揭示了除补体旁路途径异常以外致aHUS发病的新型遗传机制。迄今为止，国外已报道多例DGKE基因隐性突变致aHUS发病病例。2对来自不同家族的兄妹，均在婴儿期表现为aHUS，但没有已知的补体突变基因或抗体。Lemaire等[14]通过检测这4个aHUS患者的外显子，证实了一个家族存在DGKE纯和突变（p.Trp322*终止密码前移），另一个家族存在DGKE复合杂合突变（p.Val153Serfs*3框移突变和p.Arg64Pro错义突变）。此外，他们对47例儿科aHUS和26例成人aHUS患者的外显子测序，证实了6例儿童患者存在DGKE纯合子或复合杂合子突变，且均无补体异常；26例成人患者均未检测到DGKE突变。Lemaire等[14]还发现在起病年龄＜1岁、无补体异常的aHUS患者中，DGKE突变约占27%（13/49）；在起病年龄＜1岁的aHUS家族中，DGKE突变约占50%（3/6）。其总结DGKE突变相关aHUS的临床特点有:（1）均在1岁之前发病，这对有aHUS症状的婴儿进行基因检测具有指导意义；（2）5岁之前可多次复发；（3）即使离最后一次复发时间很长，在20岁之前多可发展为终末期肾病；（4）发展为肾病综合征；（5）aHUS 发病后，即使肾功能恢复正常，大部分患者均表现为高血压、血尿以及蛋白尿。

DGKE基因突变位点位于基因的外显子序列。然而，Mele等[29]研究了2个家族（意大利/美国）的5例aHUS患者，发现DGKE内含子突变引起的aHUS。5例患者均是儿童期起病、遗传原因不明。使用传统的突变筛选参数对全部染色体及外显子测序，意大利家族中未发现明显的补体或DGKE外显子突变；美国家族中仅有DGKE无义突变，而该突变并不致病。考虑到内含子突变可致外显子的剪接异常，他们对内含子测序发现DGKE突变点位于内含子5区（c.888+40A＞G）。进而对意大利家族的2例aHUS兄妹的DGKE mRNA进行检测，发现内含子5区突变致外显子5区的剪接异常，形成了3种异常的mRNA，而缺乏野生型DGKE mRNA。其中一种mRNA较野生型DGKE mRNA多39个核苷酸，其指导翻译的DGKE蛋白比正常多13个氨基酸，从而影响DGKE活性而致病。此外，美国家族的3例aHUS兄妹也存在DGKE非编码区的复合杂合子突变。并且这2个家族的患者均具有DGKE相关aHUS典型临床特点：1岁之前起病；多次复发；表现为蛋白尿。这是第1例关于DGKE内含子突变致aHUS发病的报道，因此DGKE外显子序列、内含子序列突变均可导致aHUS发病，且均无补体成分异常。在治疗反应上，2例DGKE突变相关aHUS患者分别接受抗C5单克隆抗体和输注新鲜冰冻血浆后出现复发，3例患者接受尸体肾移植，均未出现移植后复发情况，仅1例在6年后因慢性排斥反应导致失功。而移植后复发在补体缺陷相关aHUS患者中很常见，不予抗补体治疗常引起移植失败。因此，治疗反应也提示DGKE基因突变是区别于补体异常致aHUS的新机制[14]。

然而，近期研究发现aHUS患者可同时存在DGKE突变和补体系统异常，并且两者之间具有相互作用。2013年，Westland等[30]报道了2例DGKE截短突变相关aHUS姐弟患者在随访中均表现为持续性低C3血症，提示存在补体系统激活与消耗。2014年，一项纳入83例发病年龄＜2岁aHUS患者的队列研究发现：4例存在DGKE突变（1例纯和突变，3例杂合突变），其中3例患者同时伴有杂合子THBD或C3突变[15]。4例患者中，2例并发DGKE突变及THBD突变的患者，血浆输注疗法可控制复发并避免肾功能衰竭；1例并发DGKE突变和C3突变的患者，血浆输注疗法可使血液指标恢复正常，抗C5单克隆抗体治疗使水肿减轻；1例仅有DGKE突变的患者，未行血浆输注或抗C5单克隆抗体治疗，肾功能即恢复正常[15]。该研究提示补体基因突变可影响DGKE突变患者对治疗的反应。

DGKE突变如何导致aHUS目前尚无结论。DGKE是甘油二酯酰激酶（DGK）家族成员，能使富含花生四烯酸的甘油二酯（DAG）磷酸化为磷脂酸（PA），从而阻断依赖DAG的蛋白激酶C（PKC）系统。DGKE表达于内皮细胞、血小板，这两者是参与血凝块形成的主要细胞。当DGKE缺陷时，大量DAG不能被转化为PA而堆积，堆积的DAG可通过激活PKC，促发细胞内DAG-PKC信号通路，引起内皮细胞及血小板促血栓因子上调、血小板激活，血栓形成。

此外，DGKE还存在于足细胞，已有报道DGKE突变患者表现有肾病综合征、足细胞骨架改变及足突融合[31]。3例DGKE纯和突变的土耳其患者，表现为大量蛋白尿和低白蛋白血症，并有不同程度肾功能不全，肾脏病理表现符合肾小球微血管病（内皮细胞受损、肿胀、毛细血管腔闭塞，但也伴有双轨征、足细胞足突融合等膜增生性肾小球肾炎的表现[32]。aHUS存在足细胞损伤，局部C5b-9形成可致足细胞溶解：亚溶解型C5b-9通过释放蛋白酶、增加生长因子和活性氧等物质致足细胞结构功能受损，还可引起DNA损伤，从而限制足细胞增生和修复，并可增加足细胞上TRPC6表达，导致钙内流增加[33]。TRPC6是钙通透性阳离子通道，其功能与足细胞骨架有关。当TRPC6表达增加，细胞内钙离子浓度增加，可导致足细胞骨架重排，产生蛋白尿。TRPC6活性与DAG有关，后者通过激活PKC促使TRPC6通道开放[34]。DGKE缺陷时，大量DAG激活DAG-PKC信号通路而活化TRPC6，促使钙离子内流增加，致足细胞骨架改变、足突融合，出现蛋白尿甚至肾病性蛋白尿。

3 小结

补体途径异常和DGKE突变均可激活细胞内的DAG-PKC信号通路，进而导致血小板激活、血栓形成，并可致足细胞损伤和蛋白尿产生。同时，C5b-9聚集可激活DAG-PKC通路，增加细胞内钙离子浓度，并可增强胞质磷脂酶A2活性产生大量花生四烯酸，后者通过环氧化酶生成前列腺素E2和血栓素A2。因此，补体激活产物可改变DGKE的调节途径，使得两者在发病机制上相互关联，这对于进一步了解aHUS的发病机制具有积极的意义。