间充质干细胞对Th17/Treg平衡的影响及与IBD的关系

付正伟 王丽霞 葛海燕

辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）和调节性T（regulatory T cell，Treg）细胞是两种相互抑制功能的T 细胞亚群。Th17 细胞促进自身免疫和炎症的发展，是免疫反应的关键，然而Treg 细胞通过调节效应（effector T，Teff）细胞的活性来介导全身免疫应答并维持外周免疫耐受。Th17 和Treg 细胞的发育相互关联，在特定的微环境下以相互转化，Th17/Treg 细胞失衡可导致自身免疫性疾病的发生。间充质干细胞具有独特抗炎和免疫调节特性，可通过调节Th17/Treg 平衡来抑制或减缓自身免疫性疾病的发生发展。目前，MSCs 对自身免疫性疾病的机制研究有了很大进展，其治疗作用得到了国内外学者的认可[1]。然而，MSCs 对炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的免疫调节机制研究并不多，调节免疫和控制炎症仍是其主要方向[2]。本文就MSCs 调节Th17/Treg 细胞平衡及与IBD 的关系作一综述。

一、MSCs

（一）MSCs 的概述

MSCs 在40 年前首先在骨髓中被发现并命名为骨髓形成细胞[3]，近年来发现MSCs 具有免疫调节功能并报道MSCs 可以在体外抑制T 细胞增殖并延长体内同种异体皮肤移植物的存活时间[4]。MSCs 几乎存在于所有组织中，能够从神经、脂肪、骨髓、羊水、脐带血、胎盘、月经及牙髓中分离出来[5-6]，能够自我更新及分化成多种细胞。在不同的生理和培养条件下，MSCs 可以向间质细胞、软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞分化[7]，还可以向诸如肝细胞和神经细胞之类的非中胚层细胞转化[8]。MSCs 没有明确表达的表面抗原，但可以用不同的表面抗原来标记，其主要表达CD105、CD73、CD90、Stro-1、CD49a、CD29 和CD166 表面抗原，不表达CD34 和CD45 表面抗原、血型糖蛋白、HLA-DR 及白细胞分化抗原CD14、CD33、CD3 和CD19[9]。国际细胞治疗协会在2006 年对MSCs 的定义达成了共识[10]，共识认为MSCs 具有贴壁性，表达基质细胞抗原CD75、CD90 和CD105，不表达造血细胞表面抗原CD34、CD45、HLA-DR 或CD11b、CD19，能向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞分化。

（二）MSCs 的免疫调节功能

MSCs 对IBD 的治疗作用可能与其有效的抗炎和免疫调节特性、抑制Teff 活化及伴或不伴有Treg 数量增加有关[11]，而不在于其分化潜能[12]。尽管MSCs 的免疫调节机制尚未完全阐明，通过依赖细胞接触及诱导可溶性因子来介导细胞免疫反应可能是MSCs 发挥其免疫抑制功能的主要方式。在这两种方式作用下，MSCs 通过抑制T 细胞及树突状细胞（dendritic cells，DCs）的成熟、减少B 细胞活化和增殖、抑制自然杀伤（natural killer，NK）细胞的增殖和毒性、促进Treg 细胞的生成来调节调节适应性和先天性免疫，发挥MSCs 的免疫调节功能[13]。

1.细胞接触介导MSCs 的免疫调节：在体外的培养体系中发现细胞与细胞的直接接触是MSCs 发挥免疫调节作用的关键。Han 等[14]发现骨髓来源的MSCs 依赖细胞接触机制不仅降低了T 细胞的存活和增殖，而且还增加了Treg细胞的比例。Krampera 等[15]报道了MSCs 在培养体系中只有MSCs 与T 细胞直接接触才能发挥其免疫抑制作用。另外，研究者也发现诱导Treg 细胞的产生也依赖于MSCs与纯化的T 细胞之间的直接接触[16]。一些细胞因子可以促进细胞之间的接触，如干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）可以上调MSCs 分泌细胞黏附分子如血管间细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、半乳糖凝集素（galectin）-1 和CD274 的表达，这些细胞黏附分子有利于细胞与细胞之间的相互接触，有利于促进MSCs 发挥其免疫调节功能[17]。

2.诱导可溶性细胞因子介导MSCs 的免疫调节：诱导可溶性细胞因子的分泌是MSCs 介导免疫调节功能的重要因素。目前，研究已证实几种如转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth Factor，HGF）、吲哚胺-吡咯2，3-双加氧酶（indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）和白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等可溶性细胞因子已经介导了MSCs 的免疫抑制功能。大量实验数据显示促炎症细胞因子IFN-γ 单独或联合肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1α 或IL-1β 可诱导MSCs 分泌各种如环加氧酶-2（cyclooxygenase，COX- 2）、PGE2 和IDO 等酶或可溶性因子来介导其免疫抑制活动[18]。IFN-γ 激活的MSCs 不仅可以作为具有免疫调节特性的细胞发挥作用，而且还可以作为有效的抗原提呈细胞（antigenpresenting cells，APCs）[19]，在受TNF-α 或IL-1β刺激后，MSCs 的表型发生变化，诱导主要组织相容性复合体-Ⅰ（major histocompatibility complex，MHC-I）型抗原的表达，诱导细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1）、程序性死亡配体-1（programmed death-Ligand1，PD-L1）和VCAM-1 表达的增加[20]。在IFN-γ 和TNF-α 的协同作用下，MSCs 的激活使可溶性细胞因子 IL-6、IL-8、HGF、PGE-2 和COX-2 表达增加，同时还诱导产生具有趋化作用的趋化因子，如趋化因子CC 受体5（CC-chemokine receptor，CCR5）、CCR10、CXCR3、CXCL9 和CXCL10，这些活化的趋化因子能够抑制免疫效应细胞的增殖[21]。在这些可溶性细胞因子中，IDO 一直被关注[22]，尽管大多数研究表明IDO 具有潜在的重要免疫调节功能，但缺乏IFN-γ 受体1 和IDO 的人来源MSCs 仍然发挥重要的免疫调节功能，有研究认为这可能与MSCs 表达的Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）通过自分泌IFN-γ 信号通路来增强其免疫抑制活性有关[23]。PGE2 是另一个重要的可溶性细胞因子，通过抑制T 细胞有丝分裂和IL-2 的产生、作用于巨噬细胞诱导IL-10 的产生并阻断单核细胞向树突状细胞转化等方式发挥其免疫抑制作用[24]。其他可溶性细胞因子如IL-6、galectin-1 和白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）也参与了MSCs 的免疫调节[25]。这些可溶性细胞因子通过抑制单核细胞向DC 的分化、降低对T 细胞的刺激能力、延缓淋巴细胞和中性粒细胞的凋亡、促进Treg 细胞的产生发挥MSCs 的免疫调节作用。

3.外泌体介导MSCs 的免疫调节：MSCs 来源的外泌体是由MSCs 胞吞产生含有多种蛋白质、核酸及其他活性物质的膜囊泡，具有细胞间物质转运和信号转导功能，促进自我更新和分化，参与和调节肠炎的修复。MSCs 的免疫调节活性可能与其释放外泌体的能力有关，外泌体以剂量依赖方式在CpG 刺激的PBMC 共培养系统中对B 细胞增殖和分化产生抑制作用[26]。小鼠骨髓MSCs 分离的外泌体通过增加（fork-like transcription factor p3，Foxp3）阳性Treg 细胞比例、增加IL-10 和TGF-β1 的分泌来抑制同系或同种异体T 淋巴细胞的增殖，诱导细胞的凋亡[27]。研究还发现骨髓MSCs 分离的外泌体可以重建肠道屏障，获得肠道神经修复功能[28]。这些数据表明MSCs 分离的外泌体具有MSCs 的免疫调节功能，外泌体的应用可能成为IBD 治疗的新方向。

4.MSCs 对T 细胞亚群的调节：MSCs 具有调节T 细胞增殖和免疫功能的能力，在某些情况下将具有致炎作用的Th1 细胞向具有抗炎的Th2 细胞转化来调节其免疫保护作用。体内外的研究已证实了MSCs 能将致炎性Th1 表型转变为更具抗炎性的Th2 表型，增加Th2 分泌的细胞因子IL-4、IL-5、IL-10、IL-13 的表达[29]。MSCs 还可调节Th17细胞分化，有利于分泌IL-4 的Th2 细胞或Treg 的产生[30]。MSCs 可以通过抑制维甲酸受体相关孤儿受体γt（retinoic acid receptor-associated orphan receptor γt，ROR γt）的表达来抑制T 细胞向Th17 细胞转化，同时通过上调Foxp3 来诱导Treg 细胞的表达，诱导具有抗炎作用的IL-10、TGF-β 增加[31]。因此，MSCs 在特定的细胞因子作用下具有调节T 细胞亚群平衡的能力。

综上所述，MSCs 本身不具备免疫调节功能，在通过细胞接触、可溶性因子及其分泌的外泌体来发挥免疫抑制作用，在特定的细胞因子环境下调控T 细胞亚群平衡。

二、MSCs 与Th17/Treg 平衡

（一）Th17 的分化及调控

Th17 细胞则是最新发现的不同于Th1 和Th2 的亚群。T 细胞受体（T cell receptor，TCR）在不同的细胞因子受刺激后，CD4+T 细胞群可分化为不同的T 细胞亚群。与Th1 和Th2 分化所需的细胞因子不同，TGF-β 和IL-6 联合刺激下促使CD4+T 细胞向Th17 细胞转化[32]。尽管TGF-β 在Treg细胞的发育中起重要作用，但在炎性环境中低浓度下同样可以诱导Th17 的表达。IL-6 诱导IL-21 的产生，随后IL-21以自分泌方式扩增分化，IL-23 稳定Th17 表型并保持其产生相关细胞因子的能力。研究表明细胞因子TGF-β、IL-1β、IL-6 和IL-23 的联合作用是人CD4+T 细胞向Th17 细胞发育分化的关键因素[33]。Th17 细胞主要的转录因子RORγt可协调Th17 细胞的分化，RORγt 通过直接结合IL-17A 启动子指导IL-17A 的转录。另一个相关的核受体RORα 联合RORγt 促使更大的Th17 反应并上调IL-17A 和IL-17F 的表达。此外，其他关键细胞因子如信号转导和转录激活因子3（signal Transducer and activator of transcription3，STAT3）、干扰素调节因子4（interferon regulatory factor4，IRF4）和芳香烃受体（aromaic hydrocarbon receptor，Ahr）在Th17 细胞分化和功能上发挥了关键作用[34]。STAT3 缺乏可导致IL-17产生细胞减少。IRF4 是Th17 分化的重要因子，在RORγt表达中起重要作用。IL-17A 是Th17 细胞的关键效应细胞因子，IL- 17/IL-17R 复合物通过同型相互作用募集U-box样E3 泛素连接酶Act1 触发细胞内信号通路，Act1 与肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）和TGF-β相关激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase-1，TAK1）的结合最终激活经典NF-κB 途径，导致Th17 的产生[35]。

（二）Treg 的分类和功能

Treg 是最新发现的具有调节功能的T 细胞亚群。Treg细胞主要分为两个细胞亚群，一类是从胸腺分化来源的天然型CD4+CD25+Treg 细胞（natural Tregs，nTregs），另一类是从外周CD4+CD25-Treg 细胞诱导分化来源的诱导型Treg 细胞（induced Tregs，iTregs）。nTregs 和iTregs 通常也分别称为胸腺衍生的Tregs（thymus-derived Tregs，tTregs）和外周诱导的Tregs（peripherally induced Tregs，pTregs）。还存在许多其他调节性CD4-T 细胞，如1 型调节性T 细胞和Th3 细胞，都表现出免疫抑制功能但不表达Foxp3。Treg细胞的免疫调节功能与Foxp3 的持续表达密切相关，但短暂的Foxp3 表达对实现Treg 细胞的免疫抑制功能可能是必需的[36]。

Treg 细胞的免疫抑制机制取决于免疫环境，Treg 细胞的活化状态和靶细胞类型[37]，主要通过调节DC 功能或成熟、抑制细胞因子释放、细胞溶解及代谢破坏来发挥其免疫抑制作用。具体而言，Treg 细胞通过依赖细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA- 4）下调DC 上B7 共刺激分子CD80 和CD86，以APCs 的方式来抑制Teff 细胞的活化，诱导DC 表达IDO，将色氨酸转化为尿毒素以及将表达的 LAG-3 分子结合MHC- Ⅱ后抑制DC 成熟等方式来激活Treg 细胞的免疫抑制功能。TGF-β、IL-10 和IL-35 是Treg 细胞释放的主要调节细胞因子，这些细胞因子参与了Teff 细胞信号传导的直接抑制、IFN-γ 的调节、Treg 细胞的诱导和Foxp3 表达的维持[38]。另外，Treg 细胞可通过颗粒酶的表达诱导程序性细胞的死亡、杀死或抑制B 细胞、破坏代谢及细胞凋亡等途径来抑制Teff 细胞功能，发挥其免疫抑制作用[39]。

（三）Th17/Treg 细胞平衡

Th17 可介导慢性炎症及自身免疫性疾病，而Treg 细胞有负向免疫调节功能，纠正Th17/Treg 细胞的失衡可以维持肠道免疫稳态。尽管这两种细胞具有不同的功能特性，但这两种细胞的分化过程具有共同的调节因子。事实上，初始T细胞分化成Th17 或Treg 细胞时受到关键介质的精细调节，包括TGF-β、IL-6 和全反式维甲酸，多效细胞因子TGF-β 对于Th17 和Treg 细胞的分化都是必需的。IL-1β 可以在IL-6介导的Th17 细胞生成中替代TGF-β，在没有促炎症信号的情况下，通过抗原诱发幼稚CD4+T 细胞，在富含TGF-β 的环境中诱发iTreg 细胞的产生。相反，在TGF-β 和IL-6 都存在的环境中可诱发Th17 的产生，在低浓度下，TGF-β 与IL-6和IL-21 协同促进IL-23R 的表达，有利于Th17 细胞的分化，而在高浓度时，TGF-β 抑制IL-23R 并有利于Foxp3+Treg 的产生，反过来抑制RORγt 的功能。相反，IL-21 和IL-23 可以减轻Foxp3 介导对RORγt 的抑制，从而促进Th17 细胞的分化。因此，抗原刺激细胞分化为Th17 或Treg 细胞主要取决于RORγt 和Foxp3 这两种细胞调节因子，这两种调节因子对调节Th17 或Treg 细胞平衡起了关键性作用。

全反式维甲酸也影响了Th17 和Treg 细胞之间的平衡，它通过增强TGF-β 信号传导同时阻断IL-6 受体表达，诱导Treg 细胞数超过Th17 细胞。IL-6 也参与了Th17/Treg 平衡的调节，IL-23 促进了Th17 细胞极化，在低水平IL-6 的环境下，CD4+T 细胞向Treg 细胞分化，抑制Th17 的生成。研究已证实在小儿IBD 患者中，IL-6 和IL-23 的表达水平异常与Th17/Treg 失衡有关[40]。另外，研究证实Th17 和Treg 细胞对不断变化的环境条件下有表型转化的能力，这些表型和功能变化的细胞对某些微生物、细胞因子以及来自固有免疫细胞的信号发挥适当的免疫调节，这些Th17 和Treg 细胞表型的转化从而也影响到了Th17/Treg 细胞的平衡。

STAT3 和STAT5 分别是控制Th17 和Treg 细胞分化的重要转录因子。siRNA 对STAT3 的抑制降低了Th17 细胞的比例，增加了CD4+T 细胞群中Treg 细胞的比例。相反，STAT5 的抑制增加Th17 细胞比例，降低Treg 细胞比例。T细胞中STAT3 缺失可抑制Th17 细胞的转录因子RORγt 表达，导致T 细胞中T-bet 和Foxp3 表达增加，使Th17 细胞分化受阻，STAT3 功能亢进时RORγt 的表达增加，引起Foxp3表达减少，促使CD4+T 细胞分化为Th17 细胞。因此，调节转录因子STAT3 和STAT5 可以调控Th17/Treg 细胞的平衡，成为控制炎症的新靶标分子[41]。

综上所述，在特定的细胞微环境中，通过调控Th17、Treg 细胞特异性细胞转录因子、信号转导和转录激活因子及相关细胞因子的表达，从而调控Th17/Treg 细胞平衡。在特定的微环境中细胞因子是如何精细调控Th17/Treg 细胞平衡成为自身免疫性疾病研究的热点。

（四）Th17/Treg 平衡与IBD

IBD 是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's disease，CD)，其发病机制认为与环境、遗传易感性、感染和免疫等因素密切相关。尽管人们普遍认为IBD 是由于遗传易感宿主对环境的刺激而导致的肠道黏膜免疫紊乱引起，但其确切原因尚未完全阐明。传统观念认为，IBD 的形成机制与Th1/Th2 轴的平衡有关，而最近研究普遍认为Th17/ Treg平衡失调是IBD 发病及进展的重要因素，动物实验也证实IBD 存在Th17 和Treg 细胞的免疫表达失衡，Th17 和炎症介质表达失衡是肠道长期炎症状态的重要原因[42]。Th17 细胞在肠道炎症中的作用已经出现了很多的研究[43]，研究已发现从IBD 患者的肠道固有层中可以分离出Th17 和Treg细胞，并在CD 患者的肠道炎性黏膜中高表达IL-17+Foxp3+T 细胞，然而在正常组无表达，在肠道炎性环境中有助于分化产生Foxp3+Treg 细胞并分泌IL-17[44]。尽管在IBD 患者的黏膜中发现了大量的CD4+Th17 细胞和Th17 相关细胞因子水平升高，但这些细胞在IBD 中的真正的生物学作用仍存在争议，一些研究表明其具有致病作用，而另一些则提出保护作用[45]。然而，在人类和动物的IBD 模型中令人信服的证据表明Treg 细胞在维持黏膜耐受中起着非常重要的作用。Treg 细胞发育或功能缺陷及对效应T 细胞免疫耐受可导致小鼠肠道炎症的发生[46]。Ogino 等[47]研究发现Treg 细胞能够延缓实验性结肠炎的病程，抑制Th17 细胞因子的表达。还有动物实验研究发现维甲酸能够增强Treg 的归巢来缓解急性IBD[48]。在药物治疗IBD 的实验研究中，有实验通过调节Th17/Treg 平衡来缓解IBD 的症状及延缓IBD 的病程。研究显示艾拉莫得通过调节Th17/Treg 细胞平衡缓解了葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎[49]。益生菌菌株长双歧杆菌CH57 和短乳杆菌CH23 的混合物通过抑制巨噬细胞活化和恢复Th17/Treg 细胞平衡改善小鼠结肠炎[50]。从这些研究发现Th17/Treg 细胞失衡与IBD 的发病相关。

IBD 属于自身免疫性疾病，调控Th17/Treg 细胞平衡成为药物治疗IBD 的热点、成为新的方向。

（五）MSCs 对Th17/Treg 平衡的影响

MSCs 具有调节Th17/Treg 细胞平衡的能力，MSCs 可以抑制RORγt 的表达从而抑制T 细胞向Th17 转化，同时上调转录因子Foxp3 从而诱导Treg 的表达，诱导具有抗炎作用的细胞因子IL-10、TGF-β 表达增加[33]。研究已证实MSCs 可以激活巨噬细胞，下调IL-6、IL-23 的产生，增加IL-10、TGF-β 的表达水平。MSCs 在有细胞因子IL-4 和IL-13 的环境下可诱导骨髓间充质干细胞产生TGF-β，MSCs 与外周血单个核细胞共培养中加入细胞因子PGE2 和TGF-β可诱导Foxp3+Treg 的分化。MSCs 还通过阻止幼稚Th0 细胞分化为Th17 细胞并抑制Th17 细胞因子的产生来调节Th17 细胞亚群，同时可诱导Th0 细胞分化为Treg 细胞。有研究也发现胎盘来源的MSCs 通过调节Th17/Treg 细胞平衡缓解了移植物抗宿主病[51]，骨髓来源的MSCs 通过调控Th1/Th2/Th17/Treg 细胞平衡缓解了实验性自身免疫性重症肌无力[52]，还有研究发现人脐带来源的MSCs 通过调节外周Th17/Treg 细胞平衡来预防小鼠缺血性脑损伤[53]。这些研究均证实MSCs 具有调控Th17/Treg 细胞平衡的能力，Th17/ Treg 细胞平衡一旦被打破，MSCs 可以通过可溶性细胞因子及细胞接触的方式从新调节Th17、Treg 细胞的数量及功能，使Th17/Treg 细胞处于动态的平衡。

三、MSCs 与Th17/Treg 平衡对IBD 的影响

最新研究证实Th17/Treg 细胞平衡与IBD 发病有关。Th17 和Treg 细胞可相互转化、相互制约，共同调节肠道免疫稳态。Th17 细胞过度增加或Tregs 减少将导致Th17/ Treg细胞平衡被打破从而导致肠黏膜损伤[54]。调控Th17/ Treg细胞平衡成为治疗IBD 的主要策略之一，MSCs 通过调节关键性可溶性细胞因子及转录因子或细胞直接接触的方式来调节Th17/Treg 细胞平衡，从而缓解IBD。有研究发现MSCs 通过抑制STAT3 活化从而调节Th17/Treg 细胞平衡缓解了实验性肠炎[55]，也有研究发现经肠系膜注射的MSCs通过调节Th17/Treg 细胞平衡缓解了大鼠IBD[56]。在这些研究中均发现MSCs 通过抑制Th1、Th17 细胞数量及功能、增加肠系膜淋巴结中的Treg 细胞数量及功能，最终调控Th17、Treg 细胞及促炎、抗炎细胞因子的平衡来缓解实验性肠炎[57-59]。

四、结论

IBD 是病因不明的自身免疫性疾病。Th17/Treg 细胞平衡与IBD 的发生发展密切相关，通过调节Th17/Treg 细胞的平衡可以缓解IBD 的症状及病程。MSCs 具有免疫调节功能，在炎性环境中MSCs 可通过可溶性细胞因子、细胞接触及外泌体的方式动态调节Th17/Treg 细胞的平衡，这为IBD 的治疗提供新的方向。然而，MSCs 是否可以通过调节Th17/ Treg 细胞平衡缓解IBD 的症状及病程的研究较少，以及MSCs 是如何在复杂的肠道炎性环境中精细调控Th17/ Treg 细胞的动态平衡都需要进一步深入的研究。