脊柱结核动物模型建立的研究进展

蔡则成 马赫 戈朝晖

2017年，全球约有630万例新发结核病患者，全球结核病的治疗成功率约为83%[1]。骨与关节结核占患者总例数的5%左右，但是其中50%以上为脊柱结核[2]。近年来对于脊柱结核研究方向以药物、内置入物及缓释材料居多[3]。在建立动物模型时，通常要达到一致性、反复性、稳定性、实用性、可控性、易操作性和经济性。在落实到具体建立动物模型时，笔者就结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)菌株的配制、模型动物的选择、致敏的重要性、手术方式、术后的检测方向等加以阐述。

一、MTB菌株的实验环境

1.实验室条件：3级生物安全实验室。

2.质控标准：MTB的菌株应来源于中国医学微生物菌种保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collection，CMCC)或美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)或当地的结核病研究所。

3.感染控制：严格按照3级实验室生物安全规范与标准进行实验操作，一旦发生MTB意外感染事件，当事人应尽快就医，通报疫情，关闭实验室及消毒场所，隔离相关人员，相关部门应立即启动应急预案。

二、MTB悬液的配制

在脊柱结核动物模型的建立中，大多数采用的是MTB标准株H37Rv，同时也有用牛分枝杆菌作种植菌株，但是结果并不理想，在8周内均未出现病变椎体的新生骨及硬化壁[4]。由于MTB的胞壁为疏水性，导致了培养基中的营养物质难以渗透，决定了其为生长缓慢的菌株[5]。根据MTB的生长特性，已研究产生了十几种培养基，但是临床与科研上常用的有罗氏固体培养基和Sauton液体培养基两种[6]。林旭[7]进行菌株培养时同样采用的是上述两种培养基，缺点为取成熟菌落的时间为14～21 d，时间较长且后续对脓液进行细菌培养也耗时较长。苏明权等[8]在改良罗氏培养基的基础上加入已研究好的促生长剂配方，进行了添加促生长剂与未添加生长剂之间MTB生长状态的对比，发现菌株在含促生长剂的培养基上5～7 d即可形成肉眼可见的米粒状菌落，而在普通培养基上需2周左右才形成。这种加入促生长剂的培养基可以在细菌培养及术后取材鉴定时为研究者节省时间。因MTB在培养基中的状态为干燥颗粒状，不便于携带及种植，故其应用于动物模型种植时均配置为MTB混悬液，方法为轻柔研磨，加入生理盐水，常用的MTB浓度为5 mg/ml[9]，即1×10-7菌落形成单位(CFU)·ml-1。乔永杰等[10]通过不同的MTB混悬液浓度对于造模的成功率做了更为详细的对比研究，从组织病理到影像学的表现，通过三组不同浓度的菌量进行实验，发现1×10-6CFU·ml-1与1×10-8CFU·ml-1的死亡率及并发症较高，而1×10-7CFU·ml-1可行性及成功率较高，但是作者只是设置了3组实验，并未行更多不同浓度梯度之间的比较，导致样本量过小。

三、模型动物的选择

结核病的动物模型在微生物学鉴定、不同菌种的鉴别、细菌侵袭力的测定、病理学研究等均占有重要地位[11]。动物脊柱结核模型的建立需要产生与人类相似的病理变化，如病灶中软组织的肉芽肿、脓肿形成，椎体中的死骨及骨缺损产生，以及能够带菌存活较长时间[12]。虽然研究者对很多不同种类的动物进行了建立结核模型的实验，但是由于动物对MTB的敏感性、疾病的表现形式、个体解剖结构均不相同，导致实验的结果在不同的动物上差异很大。以下就常见的实验动物做一些比较。

1. 豚鼠：豚鼠对MTB高度敏感，只需要低剂量的MTB菌量即可产生与人类相似的肉芽肿，继而迅速发生液化坏死，故其肉芽肿的发生是进行性的，如不尽快加以干预，豚鼠的生存时间会非常短[13]。但是豚鼠对于卡介苗及抗结核药物的反应非常敏感，故豚鼠是良好的疫苗研发和治疗效果检测的结核模型。因豚鼠自身解剖结构的特点，体积小、椎体及椎板较薄、椎骨视野暴露困难，致使其适合以气溶胶的形式被感染，多用于模拟免疫功能缺陷者感染MTB，以及研究结核感染引起的超敏反应所表达的蛋白[14]。

2.小鼠：小鼠价格低廉，繁殖率较高，CD4+和(或)CD8+T淋巴细胞在炎症反应中表达明显，适应力强，非常适合在3级生物安全实验室中进行实验。大多数小鼠通过低剂量的MTB气溶胶进行感染，其他的感染途径有静脉注射、气管内注射等，多用于进行肺结核诊治的实验[15]。但是MTB并不是小鼠的自然病原体，所以小鼠对于MTB的敏感性并不高，这就导致小鼠可以携带大量的MTB而不表现出临床症状的可能性[16]。Bai等[17]研究发现，小鼠在感染MTB后巨噬细胞没有分泌一种名为白细胞介素(IL)-32的抗MTB细胞因子，导致其肉芽肿的形成与人类有很大的差异。在高剂量的MTB感染后也可出现与人类相似的肉芽肿，但是会引起致敏T细胞与细胞因子对抗原的直接杀伤，导致小鼠死亡[18]。虽然小鼠有对MTB不敏感、病灶形成不典型等不足，但是小鼠对抗结核药物的反应与人类很相似，并且转基因小鼠可以产生与人类相似的抗MTB的细胞因子；故小鼠多用于肺结核模型的建立，以及疫苗研发、抗结核药物的实验中[19]。高琪乐等[20]通过在混悬液中加入Matrigel Matrix基质胶注射入骨孔内，构建出C57BL/6小鼠脊柱结核模型，但是存在成功率较低、骨破坏面积较小等缺点。

3.兔：兔对于不同型别的MTB均有不同的表现，例如MTB的Erdman和HN878型对于兔的侵袭力非常弱，在感染之后疾病进展非常缓慢，甚至可以见到未经任何治疗措施而痊愈的兔[21]；但是选用H37Rv标准株时可以观察到与人类类似的结核病理变化、疾病进展、免疫反应的过程[22]。种植MTB时多用牛分枝杆菌与MTB，牛分枝杆菌感染后，兔会形成干酪样坏死、局部液化，适用于组织病理学的研究[23]。兔在感染MTB后可出现较典型的结核病变，在脊柱种植后可出现椎间隙狭窄、骨质破坏、寒性脓肿等典型病变，且兔的脊柱解剖很有特点，由椎体、椎板、上方的棘突、两侧的横突构成，形似三叶草，面积较大，适合进行钻孔、病灶清除、放入内置物等手术操作，但是因兔的椎体周围血管较多、椎体矢状径过短，所以对手术操作要求较高，术中易出现大血管破裂和脊髓损伤等严重并发症[24]。

4.非人灵长类动物：非人灵长类动物对MTB易感，且与人类的解剖、遗传特征等相似，理论上可以成为最理想的动物模型[25]。恒河猴(Rhesus Monkey，RMs)已经被证明是一种非常合适的结核病动物模型，其作为动物模型可以更容易地感染MTB，并且可以显示人类所有的结核病特点，从急性感染和主动感染到无症状的潜伏性感染[26]。除此之外，食蟹猴(Cynomolgus Monkey，CMs)也是非常理想的模型。Sharpe等[27]通过超低气溶胶感染的形式对两种不同类型的猴进行对比试验，发现RMs较CMs更容易感染MTB；故RMs多用于活动性结核病的研究，CMs可用于慢性或MTB潜伏感染的研究。但是迄今为止尚未见到用非人灵长类动物建立脊柱结核模型的报道。因其价格昂贵、饲养困难、容易引起疾病暴发等原因，故在结核病的研究中应用较少。

四、致敏的重要性

对于动物结核模型的建立，John于1913 年采用下肢动脉、门静脉分支，甚至于心脏直接注射MTB及敷料吸附MTB塞入骨孔的方式建立骨关节结核的动物模型。令人遗憾的是，这种方法得到的模型存活率低且样本的数量较少，但是为后面的研究者建立其他部位的结核模型提供了启发。这些建立结核模型的过程中主要存在3个问题：(1)难以获得指定部位的结核固定病灶或病灶产生不明显；(2)MTB容易经血液播散，以致还未进行实验研究，动物就因全身性的MTB感染而死亡；(3)每种动物对于MTB的敏感性都是不同的。弗氏完全佐剂是一种从动物油脂中提取的乳浊液，相当于减毒疫苗，能够诱导动物体内产生MTB抗体，增强免疫力，防止结核感染而产生过强的免疫反应[28]。为了解决上述问题，Lindberg[29]在1967年率先采用已经致敏的豚鼠，并在其股骨远端干骺端钻孔，置入明胶海绵并浸注MTB，结果发现骨质破坏和软组织肿胀在不到2个月的时间即可形成，一并解决了上述的问题。Smith和Harding[13]提到豚鼠对于MTB敏感的特性，但是术前致敏却可以提高存活率，这个现象提示了致敏对于建立模型的重要性。2002年吴启秋等[30]在国内率先将MTB直接注入兔膝关节腔内，但是与之前不同的是，兔在实验前已用弗氏完全佐剂致敏。此法成功建立了兔膝关节结核模型，发现经致敏的兔MTB产生的扩散和免疫反应较前明显降低，实验兔存活时间长，可重复性强，为国内建立结核模型兔提供了新的启示。Liu等[31]采用的是术前1个月给实验兔注射地塞米松，1周后改为地塞米松片剂喂服，但是脊柱结核的病理变化并不是很典型。2015年Geng等[32]对于建立脊柱结核模型兔的术前弗氏完全佐剂致敏与未致敏的两种建模方式的成功率做了详细对比，结果证实了术前致敏组的成功率高于未致敏组；但是纵观各个研究，均未对致敏剂的剂量做出过详细的解释，以及致敏剂的用量是否与体质量、年龄等因素有关，亦未见到有不同致敏剂的剂量与建模成功率的报道。

五、手术方式

对于兔脊柱暴露的方法主要有两种，即经侧方与后方入路。大多数学者均采用王非等[33]的侧方肌肉间隙入路的方法对兔的脊柱进行暴露，可以避免损伤腹膜、深入脏器等操作，但是后方入路也可以达到上述目的。王云玲等[34]对侧方入路和后方入路做过比较后发现，侧方入路较后方入路所诱发的结核症状出现的更早，术后MTB腹腔播散、窦道形成等并发症更少，兔的存活率更高。在兔麻醉完成后，行右侧卧位固定，常规消毒及铺巾，经横突侧腹部入路，显露腰5～6椎体，于腰5椎体下部距腰5～6椎间盘0.5 cm处从左后方向右前方，用医用骨钻进行钻孔，深度约5 mm，直径3 mm，此即为侧方入路显露椎间盘与椎体。骨孔在充分止血后填充明胶海绵并压实，用注射器在明胶海绵上缓慢浸注MTB混悬液0.1 ml，以能让明胶海绵充分填充骨孔为宜。在完成填塞后，Guo等[9]主张用骨蜡封孔，但也有未进行封孔的方式。Geng等[35]在实验中发现，若是骨孔过小、菌液有轻微溢出，则不必用骨蜡封孔，否则术后很容易脱落，造成MTB的播散，反之则可进行封孔。实验中用的明胶海绵相当于MTB的载体，绝大多数研究者采用的是明胶海绵，但是高琪乐等[20]在实验中采用了基质胶，同样达到了MTB种植的目的，这是一种对植入材料的新启发。

六、术后的检测方向

虽然尚未出现对于脊柱结核动物模型鉴定的统一标准，但是综合前面的实验研究，可以从影像学、病灶解剖、组织学染色、脓肿细菌培养等几个方面进行检测。(1)影像学：X线检查可以发现病灶椎体有骨质破坏及邻近椎间盘变窄甚至产生后凸，但这些均是脊柱结核晚期的表现；CT可以在早期显示椎旁脓肿、钙化等病变，也可以清晰显示死骨及硬化壁的形成；MRI对于脊柱结核诊断最为敏感，也是早期最准确的检测方法，可以显示脊髓受压、椎旁肌肉水肿、脓肿形成等变化[36]。(2)病灶解剖：对动物模型的病灶进行解剖后可发现肉眼可见的脓肿，脓肿呈淡黄色、无臭味；其余部位如肺、心等未见MTB播散及脓肿形成。(3)组织学染色：取动物脓壁组织行HE染色可见较多的淋巴细胞、类上皮细胞，椎体标本切片HE染色可见骨质破坏，骨小梁结构消失，周围为炎性肉芽组织。(4)脓肿细菌培养：取脓液标本进行MTB培养，可在培养基上发现生长缓慢的淡黄色菌落[37]。综合以上几个方面可以大致判定建模是否成功。

七、小结

选用新西兰大白兔建立脊柱结核模型已趋于成熟和规范，但是还存在着MTB培养与鉴定需时较长、术前致敏剂量模糊、MTB配制的最适浓度范围较窄、建模成功率低、吸附MTB材料种类较少等问题。在以后对模型的研究过程中，可以选用生长更快的培养基，条件允许下可以增加饲养动物的数量，从更小梯度的浓度开始配制MTB，以探索出更精确的最适MTB菌量浓度。对于致敏剂量可以准确到体质量与注射剂量之间的关系，以获得更恰当的免疫反应。在植入的吸附材料中，可以发现更多的不同种类的材料，并且对其进行细致的研究，从而找出对骨组织更加有亲和力的材料。对今后的结核动物模型研究时，可在多个实验条件成熟后，制定出规范化的术前准备、术中操作和术后鉴定等标准，以此提高脊柱结核动物建模的成功率。