耳郭软骨组织工程的研究进展

刘宁华 张天宇

先天性小耳畸形的治疗是整形外科修复重建领域中的重点和难点。其发病原因可能与妊娠期暴露于药物、酗酒、遗传等因素有关。据统计，全球平均发病率约为2.06/10 000[1]，我国的小耳畸形发病率约为3.06/10 000[2]。目前先天性小耳畸形的修复重建方法主要为自体肋软骨移植和人工支架植入。然而，自体肋软骨移植对医师的雕刻技艺要求较高，且可能造成胸廓畸形；而人工支架植入有可能导致感染、移植物排斥和外露等风险。耳郭软骨组织工程将具有成软骨能力的种子细胞和支架材料复合，构建具有组织形态与功能的人耳形状组织工程软骨，为先天性小耳畸形的治疗提供了新的方案。本文就目前耳郭软骨组织工程的种子细胞、支架材料、新技术与展望3个方面进行简要阐述。

1 种子细胞

耳郭软骨组织工程要求种子细胞及其分泌的细胞外基质具备与生理状态耳郭软骨相似的组织学结构及生物力学性能。理想的种子细胞应该具备以下几个特点：①取材容易，细胞量大，可尽量减少对患者的二次损伤；②增殖能力强大，同时具备成软骨能力；③与支架材料具有很好的组织相容性，黏附能力强；④生物安全性好，无明显的免疫排斥，无毒副作用和致瘤性。目前最常用的种子细胞包括自体软骨细胞、异种或异体软骨细胞、具有成软骨能力的间充质干细胞等。

1.1 软骨细胞 自体软骨细胞无免疫排斥风险，可来源于患者其他部位的软骨或残耳软骨。前者取材时会导致患者创伤和痛苦；而残耳软骨属于弹性软骨，取材简便，同时具备和正常软骨相似的结构和生物力学功能[3]，且对供区的形态和功能无影响。然而，残耳软骨组织量小，为构建正常耳郭大小的软骨组织，需要进行体外扩增以获得足够的细胞数量；而在体外培养传代可能会导致软骨细胞出现去分化现象, 使其逐渐丧失成软骨能力。康宁等[4]分离培养人残耳软骨细胞，发现细胞传至第4 代时仍保留较好的成软骨能力，但传至第7、8代时软骨细胞出现表型去分化，表明软骨细胞已丧失了成软骨能力。有研究[5-6]发现软骨细胞的去分化过程可以通过与生长因子的共培养而减缓。Shasti 等[5]发现，成纤维细胞生长因子2可促进软骨细胞增殖，而骨形成蛋白7可增加弹性纤维、Ⅱ 型胶原和Ⅲ型胶原的表达，从而减弱软骨细胞的去分化现象。Ting等[6]发现，转化生长因子β3与软骨细胞共培养时可显著增加软骨细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达，协助维持软骨细胞的表型。2009年，Yanaga等[7]将4例患者的残耳软骨细胞进行体外扩增，将2～3代的软骨细胞注射至患者下腹部皮下；6个月后取出软骨组织，经手工雕刻进行耳郭重建。随访2～5年后患者软骨无明显吸收。同种异体软骨细胞免疫排斥作用小，但是可能存在传染疾病的风险，且对供体的损伤较大。异种软骨细胞因免疫排斥严重，临床上较少应用。

1.2 间充质干细胞 骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞具有强大的成软骨能力，是软骨组织工程中的研究热点。其中骨髓间充质干细胞是研究最早、应用最广泛的种子细胞，但是它来源于骨髓，取材相对困难，数量有限，术后不良反应较多。而脂肪间充质干细胞同样具有自我更新和多分化潜能，且具有取材方便、来源充足、副作用小等优点。目前间充质干细胞主要通过以下途径诱导分化：①通过添加由细胞因子、细胞外基质成分、非蛋白类物质组成的成软骨诱导液诱导干细胞向成软骨分化；②通过基因重组技术转染诱导干细胞向成软骨分化[8]；③通过与软骨细胞共培养，模拟软骨微环境，诱导干细胞向成软骨分化[9]。然而，外源性蛋白和基因转染可能会导致病原体污染或致瘤性，且诱导过程中可能引起软骨肥大的相关基因表达增强，如基质金属蛋白酶13、Ⅹ型胶原、碱性磷酸酶等，导致软骨出现血管化或骨化[10]。因此，现在越来越多的研究致力于组织微环境对干细胞的定向分化作用，其作用机制可能与软骨细胞自身分泌的生长因子有关[11]。其中，软骨细胞分泌的骨形成蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子等生长因子可促进干细胞向软骨细胞的定向分化。Cai等[12]发现，将残耳软骨细胞与脂肪间充质干细胞共培养并植入裸鼠体内，可以显著增加脂肪间充质干细胞的体内成软骨能力。而软骨细胞分泌的甲状旁腺激素相关蛋白[11]可抑制脂肪间充质干细胞在成软骨分化过程中成骨分化的能力。

2 支架材料

理想的耳郭软骨组织工程的支架材料应具有以下特点：①生物相容性好，不易引起炎症和毒性反应；②机械强度和可塑性好，并有一定的抗磨损特性(因为耳郭形状需要长期保持，需要对抗皮肤张力维持自身特定形态)；③生物可降解性及降解可调节性；④良好的表面活性和适宜的孔径大小，有利于种子细胞黏附和增殖；⑤无免疫原性。根据来源，耳郭软骨组织工程支架材料可分为以下3类。

2.1 天然生物材料 天然生物材料取材于自然界，具有生物相容性好、毒性小、易吸收等优点，但同时也具有机械强度较差、产品不稳定等缺点。常见的耳郭软骨组织工程材料包括藻酸盐[13]、壳聚糖[14]、胶原[15]等。藻酸盐是比较常用的天然软骨组织工程支架材料，其特有的多孔结构有利于软骨细胞增殖及维持其球形细胞形态。但是藻酸盐的机械性能较差且极易降解，故限制了其临床应用。壳聚糖是甲壳质经过浓碱处理以后脱去乙酰基的产物，无味、无毒性，其结构与细胞外基质成分糖胺聚糖相似，因此它们和相应的降解产物低聚糖都具有良好的生物相容性；但单纯应用壳聚糖制成的海绵状支架材料易破碎，其机械强度及韧性达不到耳郭软骨组织工程材料的需求。胶原是一种天然蛋白质，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨和韧带等组织中，具有支撑器官、保护机体的功能。胶原也是细胞外基质中的重要组成部分，一般是白色透明、无分支的原纤维，周围基质由黏多糖和其他蛋白质构成。Deponti等[15]将耳软骨细胞与Ⅰ型胶原支架进行体外共培养，发现软骨细胞能在胶原支架上增殖，并且软骨细胞表型在共培养3周之内无明显变化。此外，脱细胞外支架材料在再造方面也有较多的研究。Utomo等[16]提出软骨来源的脱细胞外基质支架可保持原有胶原和弹性纤维的含量，其组织结构和形状也没有明显改变，并拥有一定的机械强度，可作为耳郭软骨组织工程支架材料。随后Tang 等[17]的研究证明，在无需外源性生长因子的情况下，骨髓间充质干细胞在软骨来源的脱细胞外基质支架共培养3周，可向软骨细胞分化并形成类似软骨样组织，证明脱细胞外基质支架具备诱导干细胞向软骨分化的能力。此外，为了提高耳郭软骨组织工程支架材料的抗磨性，Lin等[18]将成骨诱导的人脂肪间充质干细胞与小肠黏膜下层支架植入裸鼠背部，发现该支架能在1年内维持较好的耳解剖结构，并且具有类似正常软骨的力学性能。

无创数字摄影测量与计算机辅助设计/计算机辅助制造(computer-assisted design/computer-assisted manufacturing ，CAD/CAM)技术的逐渐成熟为生物支架材料3D 打印技术提供了很好的技术支持，可体外打印出模拟耳郭复杂曲面几何形状和微型纤维结构的Ⅰ型胶原支架[19]，支架与耳郭软骨细胞在裸鼠体内包埋6个月仍能展现出良好的对耳轮、耳轮、耳垂等耳郭标志性结构[20]。

2.2 人工合成材料 人工合成材料是人为地把各种有机高分子材料经化学聚合、静电纺技术等途径加工而得到的细胞外基质替代物。其优点是抗原性较弱，可降解，具有较好的可塑性和机械强度。缺点是降解产物为酸性，可能引起周围组织非特异性炎症反应和免疫反应。目前常见的耳郭软骨人工合成材料包括多孔聚乙烯(Medpor)[21]、聚己内酯(poly-caprolactone, PCL)[22]、聚羟基乙酸(poly-glycolic acid, PGA)[23]和聚乳酸(poly-lactic acid，PLA)[24]等。Medpor 是一种医用级线性高密度多孔聚乙烯生物材料，具有优良的组织相容性，其内部纵横交织的孔洞结构有利于细胞增殖和新生肉芽及血管长入，且材料强韧，立体感强，可切削，可免除患者切取自体软骨的痛苦。主要缺点是材料质地偏硬，再造耳郭缺乏柔韧可屈曲的生理特性，且容易产生压迫性溃疡并使支架外露。PCL、PGA和PLA是利用有机金属化合进行开环聚合而得到的脂肪族聚酯化合物，具有良好的柔韧性、抗磨损性能以及较高机械强度，同时可以被降解，取材容易。Dahlin[22]发现耳软骨细胞和间充质干细胞能在PCL支架上增殖、分化，并修复小鼠的软骨缺损。He 等[25]发明了一种熔断电流体3D 打印技术，可制备出多层3D PCL组织工程支架，通过控制发射器的速度和运动方向可精细模拟出需要的几何形状和细节结构。

2.3 复合材料 上述2类支架材料各有优、缺点，例如胶原可逐渐降解，为细胞生长提供空间，但常常降解过快，生物力学特性不及人工合成材料[15]；而合成材料大多是疏水性的，组织相容性不及天然生物材料，而且酸性的降解产物会改变种子细胞增殖分化所需的微环境[26]。复合材料是指由2种或2种以上不同物质以不同方式组合而成的材料，可发挥各个材料的优点，克服单一材料的缺陷。Sterodimas等[27]将耳软骨细胞与丝蛋白-藻酸盐3D多孔耳郭支架共培养后植入兔皮下，6周后发现细胞支架复合物有软骨组织学表现，且丝蛋白-藻酸盐耳郭支架能保持较完整的支架结构和一定的弹性，仅边缘轮廓有少部分吸收。Haaparanta 等[28]制备了胶原/PLA、壳聚糖/PLA和胶原/壳聚糖/PLA 3类3D多孔复合支架材料，研究发现胶原/PLA材料具有最好的亲水性能且软骨细胞在该3D支架上的渗透能力最好。Liu等[29]将PLA和PGA混合并制备类似人耳形状的支架，发现20% PLA的加入可显著提高PGA的力学性能，并且对PGA支架的细胞亲和力、纤维结构没有明显影响。Lee等[30]制备了不同比例的聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)和丝蛋白(silk)复合支架，发现50∶50 的PVA-silk复合支架与单纯支架相比具有更好的生物学相容性和力学强度，且PVA-silk植入大鼠皮下6周后仍能有较好的支架结构。

3 展望

目前耳郭软骨组织工程正在迅猛发展，选择和改进种子细胞和支架材料是优化耳郭软骨组织工程的关键，需要细胞生物学、工程材料学和临床医学等多学科的配合。

1997 年,Cao等[31]采用软骨细胞复合PGA-PLA耳郭3D支架成功在裸鼠皮下构建出具有人耳郭形态的组织工程软骨，给耳郭重建领域翻开了新的一页。很多学者开始着力于研究耳郭组织工程软骨。现在在体外或体内成功构建形态逼真的耳郭组织工程软骨的技术日趋成熟，然而要应用于临床仍然面临诸多挑战：①种子细胞来源和分化的选择，既要满足构建人耳郭软骨的数量及质量，还需要考虑到血管化、骨化等因素对软骨组织的影响；②需要提高耳郭组织工程软骨的力学性能和抗磨性能，有利于其对抗皮肤张力，维持自身特定形态，长期保持耳郭的形状；③因为生长因子诱导细胞增殖的同时可能导致软骨表型的缺失[5]，因此需要在软骨细胞体外培养的适宜阶段，时序性添加生长因子以达到增殖与维持表型的双重作用；④需要协调软骨细胞再生与耳郭组织工程支架在体内降解的速度，以免支架降解过快导致耳郭支架结构的缺失；⑤需要大量且随访时间长的动物或人体实验来验证耳郭组织工程软骨的长期稳定性和安全性。目前绝大多数耳郭组织工程软骨方面的研究仍停留在动物的体内实验阶段，距离应用于临床尚有较大差距。耳郭组织工程软骨领域的研究应从种子细胞、生物材料、体外构建技术等基础科学问题入手，对目前存在的问题进行针对性的深入研究，以逐步突破耳郭软骨组织工程所面临的困境。