间充质干细胞的生物学特性及应用

弓勋 综述；云升 审校

（内蒙古医科大学附属医院 干细胞研究中心，内蒙古自治区 呼和浩特 010010）

间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一类多能干细胞，最初被发现于20世纪50年代，研究发现其来源于发育早期中胚层，其具有高度自我更新的能力以及向多种细胞分化的潜能，是人类和小鼠骨髓单层细胞培养中存活时间最长的细胞[1-3]，通过研究表明，它们可以在体外和体内通过不同方式诱导分化为脂肪组织细胞、软骨组织细胞、结缔组织细胞和骨组织细胞及神经干细胞。另外也有研究表明，MSC也可能被诱导分化为内胚层细胞（肺细胞，肌细胞和肠上皮细胞）及外胚层细胞（上皮细胞和神经元）[4-5]。基于其独特的分化能力及低免疫原性，MSC在再生医学、疾病的临床应用治疗中起到了很大的作用。本文通过对MSC的生物特性、不同来源MSC的形态、增殖、表面标记物的比较及MSC在部分疾病的临床应用作简要综述。

1 生物特性

近年，因MSC被发现越来越广泛的医学价值，研究也越深入，目前的研究表明MSC可以从骨髓、脐带血、脐带、胎盘、动员外周血、脂肪组织、牙髓、甚至胎儿肝脏和肺组织体外培养扩增获得[6]。MSC虽然来源多样，但具有一些共同的特点：在显微镜下观察呈成纤维细胞形态，常为梭形或纺锤形，其胞质丰富，普遍具有贴壁生长特性，增殖率较高，表面均表达标志物CD90、CD105、CD44、CD73、CD9和非常低水平的CD80，对造血细胞的表面标志物包括CD34、CD45、CD11b、CD11c、CD14、CD19、CD79a、CD86 和 组 织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）II类的表达均为阴性[7-9]。且其具有分泌胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子及肝细胞生长因子等的能力[10]，在特定条件下进行诱导分化可分化为骨细胞、软骨细胞以及脂肪细胞，且其免疫原性较低，在异体之间行MSC移植后，也不易引起免疫排斥的反应。随着对MSC临床治疗的需要，国际间充质及组织干细胞委员会对人来源的MSC提出了最低的鉴定标准： ①在标准条件下进行培养，须具有对塑料性质底物的黏附特性；②通过流式细胞术检测MSC的表面标志物中CD105、CD73及CD90表达的阳性率应≥95%，且 CD45、CD34、CD14或 CD11b、CD79a或CD19、人类白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen-DR, HLA-DR）阴性表达率≥98%;③在体外通过标准方法进行诱导后，MSC须能诱导分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等[9]。

2 不同来源MSC的比较

目前临床应用较多的为骨髓来源MSC（bone marrow-MSC, BM-MSC）、脐带来源MSC（umbilical cord-MSC, UC-MSC）和脐血来源MSC（UCBMSC），不同来源MSC虽然具有一些共性，但也具有一些不同的特性。MSC最早被发现存在于骨髓中，但骨髓的采集为有创操作，这使得BMMSC的来源受到很大程度的限制，同时BM-MSC存在病毒感染的风险，并且随着采集者年龄的增长，其细胞数量、分化能力、扩增能力会出现明显的下降趋势。通过研究的不断深入，在人脐带及脐血中也发现MSC的存在，并且均具备向多种细胞分化的潜能及支持造血的能力[11]。笔者总结了下述几点来比较这3种不同来源的MSC。

2.1 细胞形态比较

周敦华等[12]对BM-MSC和UCB-MSC分别在L-DMEM体系和MSC专用培养基中进行培养，结果表明这2种不同来源的MSC在不同培养基中培养后的细胞形态、集落数、集落大小均无显著差异，但成人BM-MSC与UCB-MSC相比较，集落交错融合时间更早，集落形成的更快。吕璐璐等[13]对比了BM-MSC和UC-MSC在倒置显微镜下的形态，可见2种不同来源的MSC在显微镜下均呈梭形、纺锤形，1周后则生长速度开始增快，形成形状较均一的梭形细胞，呈旋涡形生长或平行排列的生长，二者形态相似。这表明3种不同来源MSC在集落形成或融合时间上可能存在差异，但通过培养传代后细胞形态无显著差异。

2.2 增殖特性比较

有研究表明，UC-MSC表现出更类似于胚胎干细胞的基因表达谱，并且较BM-MSC具有更快速的自我更新能力[14]，这使UC-MSC倍增的时间较BM-MSC的增殖时间明显缩短，并且脐带来源的P1代MSC倍增的时间并不随着传代次数的增加而延长，而骨髓来源的P1代MSC倍增时间传代至P6代时明显延长。这提示着，不同来源但数量相同的MSC在相同时间下扩增，UC-MSC可得到较BM-MSC数量更大的间充质干细胞[13]。邹叶青等[15]通过实验对比UCB-MSC和BM-MSC增殖性表明，UCB-MSC培养的成功率低于BM-MSC，虽然在早期阶段中UCB-MSC的增殖速率快于BM-MSC的增殖，但经过长期培养UCB-MSC的总量少于BM-MSC的总量。周敦华等[12]在15 份脐血中仅有4份脐血培养出MSC。这一结论与Erices等[16]报道的脐血标本中约1/4可体外培养出MSC的结论相符合。

因此，3种不同来源MSC相比较，UC-MSC增殖时间更短、增殖能力更强，UCB-MSC早期时具有较高的增殖性，但体外培养分化的成功率较 低。

2.3 表面标志物比较

通过对细胞免疫表型研究分析显示，UC-MSC的大多数免疫标记物与 BM-MSC的表达相似，但是HLA-ABC和CD106的表达低于BM-MSC。而HLA分子可以引起MSC移植时的免疫排斥反应，这就提示UC-MSC比BM-MSC具有更低的免疫原性。CD106是一类与造血干祖细胞的定位、迁移、增殖和分化有关的黏附分子。UC-MSC对CD106的低表达可能是UC-MSC 与BM-MSC的鉴别点之一[13]。通过流式仪分析UCB-MSC和BM-MSC表面标志物的细胞百分率表明，这2种MSC虽然来源不同，但均表达CD29、CD44及CD105等细胞黏附分子的标志物，而造血细胞标志物CD13、CD14、CD34及CD45均为阴性，随着细胞传代的增加其免疫表型并未发生改变。这提示UCB-MSC与BM-MSC具有相同的细胞表面标志物[17]。通过对这3类MSC免疫表型的分析提示，3种不同来源MSC免疫标记物大多数表达相似，UC-MSC可能具有更低的免疫原性，CD106可能成为BMMSC与外周MSC鉴别点之一。

2.4 多向分化能力比较

有实验对BM-MSC、UC-MSC及UCB-MSC多向分化能力进行比较，将3种不同来源MSC在特定条件下诱导成脂、成骨分化，对脂肪细胞通过油红O染色进行鉴定、Vonkossa染色对成骨细胞鉴定，并通过逆转录-聚合酶链反 应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）鉴定，表明3种不同来源MSC通过特定条件下进行诱导分化，均能诱导为脂肪细胞、成骨细胞，且分化能力无明显差别[13, 15, 17]。

3 在临床疾病的应用

3.1 在系统性红斑狼疮中的应用

目前系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）临床最普遍的是应用免疫抑制药物进行治疗，即皮质类固醇和环磷酰胺[18]。但长期应用该类药物存在较多副作用，移植MSC成为一种新型治疗方法。Wang[19]对16名难治性SLE患者移植UC-MSC，通过SLE疾病活动指数（SLE Disease Activity Index, SLEDAI）、 血 清 抗核抗体（antinuclear antibodies, ANA）、血清补体C3和C4、抗双链DNA抗体（抗dsDNA）、肾功能及白蛋白水平的测量来评估移植前后病情变化，所有患者的临床症状得到缓解，疾病的活动性均显着降低，且未发现与治疗有关的死亡。杨桂鲜等[20]对40例难治性SLE患者移植UC-MSC治疗，并进行系统的临床分析，通过在不同时间间隔分别对治疗前及治疗后进行SLEDAI评分并行实验室化验来对比MSC移植的影响，结果表明在常规治疗基础上加用MSC能够更快地控制患者病情，疗效更稳定，复发率更低，且未发现与移植相关的并发症。王治国等[21]通过实验观察BM-MSC对SLE小鼠的血清抗ds-DNA抗体、尿蛋白、肾脏组织的病理形态，以及小鼠末梢血液、脾脏、胸腺组织中CD4、CD25的表达和T细胞水平等指标监测治疗效果，结果显示：BM-MSC移植可改善SLE小鼠各器官的病理损伤，对SLE的实验治疗有效。综上所述不同来源的MSC均可导致疾病活动性的降低，血清学的改变和促炎细胞因子的稳定对SLE临床症状的改善、疾病的治疗具有一定的疗效，且未出现与MSC相关的并发症。

3.2 在肝纤维化中的应用

肝纤维化是慢性肝脏疾病向肝硬化发展的中间过程，而肝星形细胞（hepatic stellate cell,HSC）的活化促进细胞外基质生成，是肝纤维化发生发展的关键步骤。目前临床上治疗肝纤维化主要着重于病因治疗，并从纤维化发生的各个路径抑制纤维化的发生和发展，但长期应用药物治疗价格昂贵，且易出现较多副反应。Chen[22]通过实验将BM-MSC与HSC进行共同培养后，通过测定HSC的增殖情况及α-平滑肌肌动蛋白（α smooth muscle actin, α-SMA）的表达水平判断治疗效果，结果表明，BM-MSC通过Notch信号级联在体外直接调节HSC，从而抑制HSC的生成。施启鹏等[23]对诱导肝纤维化的SD大鼠模型进行BM-MSC移植治疗，并在治疗后通过测定肝脏功能指标，观察肝脏组织纤维化的程度及肝脏炎症发生的程度，肝组织内的α-SMA、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和COL I表达的水平，证明通过尾静脉进行BM-MSC移植治疗可以显著改善肝纤维化大鼠的肝脏功能，并减轻肝纤维化的程度。郭圆圆等[24]进行实验，对四氯化碳（CCL4）诱导的肝纤维化大鼠模型静脉注射间充质干细胞条件培养基（MCS-CM），并进行病理分析及相关检验，证实MSC对肝纤维化具有治疗作用，而其作用机制可能与MSC能够抑制HSC的活化、降低TGF-β1的表达并促进胶原蛋白降解相关。

4 MSC的安全性与展望

基于MSC独特的生物学特性，其在临床应用及治疗中被寄予很大的希望，这也引发一系列关于人类使用体外培养扩增的MSC的安全性的问题。特别是它们在体外长期扩增时的遗传稳定性、冷冻保存时对MSC性质的影响及MSC在实验室制备中的质量控制。MSC具有癌细胞的一些特征，包括寿命长、相对凋亡抗性和长时间复制能力。因此，MSC的致瘤性经常被看作是MSC临床应用的主要障碍。Wang[25]通过食蟹猴模型进行MSC致瘤性研究，通过观察模型的体重、生命体征、血液生化指标、免疫功能、器官重量、组织病理学检查，未发现与MSC相关的显着变化。该研究结果表明MSC的移植不影响生命的一般健康。Centeno等[26]通过体外培养扩增MSC后注入339例患者外周关节或椎间盘中，通过增强磁共振（MRI）追踪监测，在任何MSC再植入部位都未检测到肿瘤并发症。Liu[27]等发现IL-6能够激活Src信号通路从而增加胃恶性肿瘤细胞的运动活性，进而促进胃癌的进展，而BM-MSC能够促进白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的分泌，这也引发了研究人员对MSC安全性的探讨，进而促进胃癌的进展。

因此，虽然有大量实验研究及随访资料表明MSC在临床中应用具有广阔的应用前景，但MSC制备的条件与标准还需要进行更详细的制定和规范，且其临床应用的安全性还需要大量实验及数据进行研究分析，但随着MSC的进一步了解及深入的研究，笔者相信MSC会在医学方面造福人类。