血清miR-101与miR-25在胃癌手术患者中的检测价值

冯玉梅，李思颖

(1.江苏省连云港市赣榆区人民医院检验科 222100；2.江苏省连云港市赣榆区中医院检验科 222100)

近年来，胃癌的发病率及病死率不断攀升。据统计，胃癌的病死率已升至恶性肿瘤病死率第1位，是第4种常见癌症类型[1-2]。胃癌并不是不可医治的，早期胃癌的5年生存率在90%以上，而晚期胃癌的5年生存率仅有20%左右[3]，可见对于胃癌的早期确诊可以使患者早日接受治疗，大大提高患者的生存率[4]。有研究表明，胃癌患者组织细胞中某些微小RNA(miRNA)的表达发生了较为明显的变化[5-6]，因此有学者指出可将miRNA的表达变化作为胃癌诊断的标志物[7]。本研究选取于连云港市赣榆区人民医院接受治疗的胃癌患者，对患者的血清和健康人血清标本中的 miRNA-101(miR-101)与miRNA-25(miR-25)表达水平进行检测及比较，旨在为血清miR-101与miR-25在胃癌手术患者中的检测价值研究提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2014年1月至2016年12月于连云港市赣榆区人民医院接受手术治疗的82例胃癌患者为研究对象，其中男51例，女31例；年龄34～76岁，平均(57.6±7.8)岁。另选40例健康人作为对照组，其中男18例，女22例；年龄35～77岁，平均(58.1±7.4)岁。两组研究对象年龄及性别上的差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有患者均符合以下标准：(1)无其他恶性肿瘤；(2)经诊断符合胃癌病理“金标准”；(3)接受过化疗；(4)无沟通障碍；(5)患者及家属知情并签署研究知情同意书。

1.2主要仪器及试剂 (1)仪器：恒温振荡器(THZ-C，北京瑞邦兴业)，CO2培养箱(SCO2W-2，美国SHELLAB)，离心机(TGL-20M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，紫外分光光度计(SpectroArt 200，美国 WEALTEC)，聚合酶链反应(PCR)仪(ViiA7,美国应用生物系统公司)，漩涡混合器(QL-902，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)。(2)试剂：Trizol试剂(杭州新景生物试剂开发有限公司)，氯仿(北京鑫鼎鹏飞科技发展有限公司)，异丙醇(广州市麒旭化工有限公司)，反转录试剂盒(杭州主诺生物科技有限公司)，100%乙醇(上海化学试剂有限公司)，MMLV反转录酶(宝生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1标本收集及保存 经患者及家属同意，胃癌组患者在手术3 d前及手术3 d后抽取静脉血，静置沉淀后经离心10 min，取上清液并冷存于-80 ℃的液氮中进行待检。另外抽取对照组研究对象的静脉血标本静置离心并保存，作为对比。

1.3.2实时荧光定量PCR检测miR-101及miR-25表达水平 (1)提取总RNA：将冷冻柜中的血清标本取出，加入Trizol试剂进行反复颠倒直至混合均匀；将裂解液加入到EP管中，静置后加入氯仿并进行震荡、静置，之后置入离心器中离心15 min；去上层水后将离心液加入到新EP管中，加入异丙醇试剂并进行静置，离心10 min；去除上清液后加入乙醇洗涤、离心5 min后再次去除上清液；将沉淀中的RNA在室温下自然干燥后用Rnase-free水进行溶解，将RNA溶液置于-80 ℃冷冻柜中保存。(2)RNA水平及纯度检测：去RNA溶液样品1 μL，加入去酶水进行稀释后，读取紫外分光计在260 nm及280 nm处的吸光值，并根据读值计算RNA的水平及纯度(RNA水平=A260×40×稀释倍数)。(3)PCR反转录反应：将6 μL RNA、4 μL 的qRT Super Mix、1 μL的1 mol/L RT stem loop primer、9 μL的Rnase-free水混合制备20 mL的反应体系，在16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 4 min的反应条件下进行反应；在95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环40次的条件下进行PCR扩增，将合成的cDNA作为模板，并加入premix、探针进行反应；采集荧光并将U6sRNA作为内参检测miR-101及miR-25的表达水平。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0软件对研究中得到数据进行统计学分析。所有变量采用正态性检验，表达水平进行2-ΔΔCt计算并进行对数转换。将结果进行LSD-t检验，两组计量结果比较采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miR-101及miR-25纯度及水平 经检测结果显示，患者标本中RNA的A260/A280均大于1.8而小于2.0，水平均大于20 μg/mL而小于50 μg/mL，符合进行后续试验的标准。

2.2两组研究对象血清miR-101的相对表达水平 PCR扩增反应后回收条带，回收条带如图1。胃癌组患者术前miR-101的相对表达水平为0.732±0.147，术后为1.543±0.262，均明显低于对照组miR-101的相对表达水平(2.394±0.476)，差异均有统计学意义(P<0.05)；胃癌组患者术后miR-101的相对表达水平高于术前，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 PCR反应回收条带

2.3两组研究对象血清miR-25的相对表达水平 胃癌组患者术前miR-25的相对表达水平为2.648±0.139，术后为1.271±0.270；对照组miR-25的相对表达水平为-0.087±0.019；胃癌组患者血清术前、术后的miR-25的相对表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；患者术后miR-25的相对表达水平低于术前，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

胃癌作为一种恶性肿瘤，在早期发现并且进行诊治可以大大提高患者的存活率，但是由于胃癌在早期的症状表现通常不够明显，在胃癌早期进行确诊具有一定的难度，因此胃癌的病死率居高不下，成为威胁人们身体健康以及生命安全的一大危险因素。miRNA是近年来发现的通过控制靶蛋白来控制细胞的生理过程的一种非编码单链小分子RNA[8]。有研究表明，miRNA具有影响肿瘤细胞发展进程的作用，在肿瘤发展过程中，不同miRNA的表达水平发生了不同的变化[9]。因此，有研究指出，miRNA对于肿瘤的发展进程的判断具有重要价值[10]，但是也有学者表示，血清miRNA表达谱与肿瘤细胞中miRNA表达谱并不一致[11]。为探讨胃癌患者血清中miR-101与miR-25诊断价值，本研究比较了胃癌患者与健康人体血清中miR-101与miR-25表达水平的差异，也比较了对于同一胃癌患者术前术后miR-101与miR-25的变化水平，旨在为miR-101与miR-25在胃癌中的诊断提供思路。

有研究表明，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤疾病中，miR-101可以通过抑制多种靶基因的表达来抑制多种肿瘤细胞的增长[12]；同时miR-101的表达可以抑制癌细胞上皮-间质转化过程，而细胞上皮-间质转化可以减少细胞间的黏附蛋白，使癌细胞的转移与扩散加速[13]。因此miR-101的表达可以抑制癌细胞的增长、转移与扩散，而miR-101的低表达会使抑制作用减弱，从而促进肿瘤的发展。本研究中胃癌组患者术前及术后血清miR-101的相对表达水平均明显低于对照组(P<0.05)；患者手术后miR-101的表达水平明显高于术前，差异有统计学意义，验证了之前研究中对于miR-101诊断价值的推断。

miR-25在肿瘤疾病中的研究较多，据研究显示，miR-25在多种肿瘤发生时表达水平发生了上升，而在结直肠癌等其他肿瘤发展进程中表达水平上调，因此在胃癌中miR-25表达水平动态变化存在一定争议。本研究中胃癌患者术前、术后血清miR-25的相对表达水平均明显高于对照组，患者手术后miR-25的表达水平明显低于术前，差异均有统计学意义(P<0.05)。

综上所述，与健康人相比，胃癌患者血清中miR-101的相对表达水平下降，而miR-25的相对表达水平上升；胃癌患者手术后miR-101的表达水平明显上升，而miR-25的表达明显降低。因此说明miR-101与miR-25的表达水平可以作为胃癌诊断的标志物。

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