HPV感染相关问题的再认识

陈志辽 林仲秋

作者单位：510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院妇产科

宫颈癌是妇女最常见的生殖道恶性肿瘤。人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是其主要病因，持续高危型HPV（high-risk human papillomavirus，HR-HPV）感染可引发宫颈病变及宫颈癌。外阴和阴道上皮内病变的病因与宫颈上皮内病变同源，亦与HPV感染密切相关。HPV感染的处理主要参考《2015年美国疾病控制和预防中心对HPV感染的诊治规范》，该规范不断更新，主要包括HPV疫苗的推荐、生殖器疣的其他治疗方案及宫颈癌筛查［1］。本文就HPV感染、检测和治疗的研究进展进行回顾。

1 HPV感染导致宫颈癌的致病机制

德国病毒学家豪森在1974年发现了HPV，指出HPV是DNA病毒，并从宫颈癌患者体内克隆出HPV 16型和HPV18型，首次提出宫颈癌与HPV感染关系密切。目前，已发现100余种HPV亚型，其中30多种与宫颈感染和病变有关，根据其致病能力大小分为高危型和低危型两种。国际癌症研究协会的病例对照研究表明，高危型主要有 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 等 15 型，主要可导致高度鳞状上皮内瘤样病变（high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）和宫颈癌的发生，HR-HPV感染的低度鳞状上皮内瘤样病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）易进展为 HSIL；HPV 6 、11、40 、42 、43、44 、54 、61、70 、72、81等 11型归为低危型，主要可引起生殖道肛周皮肤和阴道下部的外生性湿疣类病变、扁平湿疣类病变和LSIL，多呈一过性，可自然逆转。

HPV通过伤口侵入宫颈鳞状上皮基底层细胞，脱去外壳，进入细胞核，将DNA整合到宿主DNA，形成E6、E7片段；基因通过表达，产生特殊蛋白，抑制p53，导致细胞异常增生，液基细胞学可检测到意义未明的不典型鳞状细胞（atypical squamous cell of undermind significance，ASCUS）、LSIL、HSIL 等细胞学改变，阴道镜活检则可发现LSIL到HSIL的病变［2-6］。HPV亚型检测对宫颈癌早期诊断及治疗具有重要意义［7］。刘桂艳等［8］采用第二代杂交捕获试验（hybridcaptureⅡ，HCⅡ）检测278例宫颈疾病患者，发现HPV-DNA在宫颈癌中的阳性表达率为91.3%（21/23），明显高于其在慢性宫颈炎中的阳性表达率30.7%（51/166），差异有统计学意义（P＜0.01）。然而，仍存在 HR-HPV 检测阴性的宫颈癌，且大约10%的宫颈腺癌发生与HPV感染无关，主要包括胃型黏液性腺癌中的微偏腺癌、透明细胞癌、中肾管腺癌以及浆液性腺癌，这些特殊类型的宫颈腺癌因临床表现缺乏特异性、常规筛查手段难以发现、病理诊断困难等原因，易漏诊、误诊，导致错过最佳治疗时机，预后不佳［9］。

2 HPV感染相关的其他疾病

2.1 HPV感染与头颈部肿瘤

HPV感染在口咽部肿瘤中有与EB病毒相似的发病机制。预防方面要注意食物卫生和口腔黏膜损伤，嚼槟榔可引起口腔癌不仅是由于化学成分，还因为口腔损伤暴露了口腔鳞状上皮的基底膜细胞。有研究显示头部和颈部鳞状细胞癌（HNSCC）与HPV感染有关，而感染HIV病毒者更易感染与HPV相关的疾病［10］。

2.2 孕前HPV感染的处理

研究报道有HPV感染的产妇传染给新生儿的比例约为10%，可能是年轻且未有性生活女性患宫颈癌的危险因素［11-12］。王晓昌等［13］对西北地区524例不孕症女性的宫颈标本进行HR-HPV检测，发现不孕症女性患者中，HR-HPV感染与支原体和衣原体感染有关。周潞等［14］研究亦报道HR-HPV感染可能是女性不孕症的危险因素之一，且HPV阳性不孕患者中绝大部分为HR-HPV。因此认为，对不孕患者检测和治疗HPV感染，可能是提高妊娠率的方法之一。

3 HPV的检测

HPV感染引起的宫颈上皮内病变并不是单向的病理生理学发展过程，会随各种影响因素改变而出现消退、持续不变或继续发展。宫颈上皮内病变发展过程的缓慢性为早期诊断提供机会。HPV检测有不同方法，各有其特点［15-16］。

3.1 HPV 抗原的检测

HPV感染人体表皮细胞后，在细胞内增殖合成衣壳蛋白而成为HPV抗原成分，免疫酶染色可检测感染组织细胞内的HPV抗原成分，判断有无HPV感染。HPV抗原阳性对诊断HPV感染或尖锐湿疣具有重要意义。

3.2 HPV 抗体的检测

在HPV感染早期，由于感染时间短，HPV尚未诱导产生抗HPV抗体，血清中可能检测不到抗HPV抗体。随着HPV感染时间延长，HPV诱导产生抗HPV抗体，并可在血清中检测到，且抗体阳性亦可反映曾感染该病毒。

3.3 HPV-DNA 检测

HPV检测还可取病变组织和局部组织黏液、分泌物进行HPV-DNA检测。目前认为聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）是检测 HPV-DNA 及分型较好的方法，是诊断尖锐湿疣及HPV感染最常用的技术，HPV-DNA检测主要包括以下方面。

3.3.1 DNA印迹杂交 该法利用碱基互补原理，通过同位素标记的核酸探针检测HPV核酸，并对病毒DNA进行分型，早期HPV检测研究中应用较多。缺点为敏感性低、耗时、对样本要求高。因此，不适用于临床HPV分型的检测。

3.3.2 原位杂交技术（in situ hybridization，ISH） ISH主要用于研究宫颈组织细胞内是否含有HPV的DNA，不需从组织细胞中提取核酸，能在成分复杂的组织中进行单一细胞研究而不受组织细胞内其他成分影响，并可完整地保持组织和细胞的形态。缺点是灵敏度较低、实验周期长、操作复杂、实验过程易受多方条件限制、无法同时检测多份标本等。还有一种是利用荧光原位杂交法检测高度鳞状上皮病变标本中HPV E6、E7 mRNA，其敏感性为 83.3%，特异性为91.3%。

3.3.3 PCR PCR技术采用DNA聚合酶催化特异性引物选择性扩增HPV的DNA，既可检出HPV已知序列，亦可检出未知序列。结合直接测序法不仅能对HPV-DNA分型，还可发现HPV少见和变异类型。缺点是PCR扩增产物检测通常用琼脂糖凝胶电泳，该法敏感性较差且结果不易保存。实时荧光定量PCR在常规PCR基础上将基因扩增、分子杂交和光化学在封闭条件下进行，实现了实时动态检测和结果自动分析，从根本上解决了扩增产物污染和不能定量的问题。此法通过探针杂交进一步提高了HPV-DNA检测的特异性，具有快速、简便、敏感性高、特异性强等优点，适用于临床工作和大规模筛查。缺点是该法主要针对HPV6、11、16和18型感染，易漏诊其他HPV亚型。而分析HPV型别时则需应用多通道实时荧光定量PCR技术，通过采用多种具有不同激发/发射波长的荧光物质标记或通用特异性探针进行示踪检测HPV的DNA，实现在同一反应管内对不同基因型别进行检测。该法特异性和敏感性均较高，分型的同时还可准确定量。缺点是分型检测时工作量大，仪器较昂贵，限制了其广泛应用，目前市场上还未见可分型的荧光PCR产品。

3.3.4 HCⅡ HCⅡ利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大，可检测13种HR-HPV。该技术采用两种特异性探针：高危型探针检测 HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、59 和 68 型；低危型探针检测 HPV 6、11、42、43、44型，方法标准化，检测效率高。缺点是不能对HPV进行分型，当任何一种型别的HPV DNA超过阈值，其检测结果均为阳性。此外，高危型探针可与其他型别HPV交叉反应，例如HPV 53、66、67和73型，从而产生假阳性结果，降低特异性。

3.3.5 低密度基因芯片导流杂交技术该技术提高了分子间的相互作用，将传统杂交法的二维平面作用提升至三维空间的相互作用，提高了DNA分析的特异性，达到临床快速检测的要求。省时、样本和试剂量较少，降低了检验成本，提高检测效率，操作方便，背景干净，且不发生常见的交叉污染现象。此外，还可一次性检测出21种HPV亚型，包括13种HR-HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和 68型）、5种低危型HPV（HPV 6、11、42、43 和44型）和3种中国人群常见 HPV病毒类型（HPV53、66、CP8304型），同时能检测出混合型感染，最终给出HPV病毒感染分型结果。HPV检测的敏感性和特异性均在95%以上，阴性预测值和阳性预测值分别为94.80%和 98.27%［17］。

3.3.6 Invader technology技术 该技术可检测出HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14种HR-HPV病毒。优点是可不经过PCR扩增，减少了产生污染的环节；缺点是不能进行分型。

3.4 HPV RNA 检查

逆转录扩增法（Aptima-mRNA）是经美国FDA批准的第一个HPV mRNA检测技术，是基于E6、E7 mRNA的新一代HPV检测技术，可直接检测出基于HPV的2个致癌基因E6、E7 mRNA，降低传统HPV DNA检测对一过性HPV感染的检出率，可识别出真正有癌变风险的HPV感染。该技术有两种检测试剂盒，分别是Aptima HPV（AHPV）和Aptima HPV 16/18/45 Genotype（AHPV GT），后者可对前者阳性结果进行分型检测。

总之，不同HPV检测技术对同一样本的检测结果可能不同，所有HPV检测方法均存在一定假阴性率，宫颈癌患者HPV检测结果亦可为阴性，其中30岁以下（尤其是25岁以下）年轻妇女一过性HPV感染率高达91%。因此，HPV检测以分流细胞学异常者为目的，而30岁以上妇女既可采用细胞学筛查，也可采用HPV筛查，两者联合筛查效率最高。

4 HPV阳性的处理

HPV阳性的处理方法有随访观察、物理治疗、光动力学和手术治疗。有研究将HPV阳性患者分为单纯随访组和物理治疗组，并定期随访薄层液基细胞学（thin-cytologic test，TCT）和 HR-HPV。经 6、12、24个月随访，发现HR-HPV（－）组无疾病进展病例；HRHPV（＋）组疾病进展4例，物理治疗组疾病进展1例。HR-HPV（－）组与 HR-HPV（＋）组的疾病转归率差异有统计学意义（P＜0.05）；物理治疗组疾病进展率低于HR-HPV（＋）组，差异有统计学意义（P＜0.05）；且持续HR-HPV感染导致LSIL进展的可能性更高。认为持续性HR-HPV感染是LSIL进展的高危因素，应合理选择治疗方式，且LSIL治疗提倡规范化、个体化和人性化［18］。

有研究显示光动力学治疗HPV感染和宫颈内瘤样病变有一定效果，且安全［19］。李华萍［20］选取阴道镜下活检为LSIL且经HCⅡ法检测的HR-HPV阳性患者138例，根据患者病变程度、意愿、年龄及生育要求分成3组，分别采用随访观察、物理治疗及宫颈高频电波刀电圈切除术（LEEP）处理，6个月及12个月复查，发现随访组病变缓解率、HPV清除率明显低于治疗组（P＜0.05），但两组病变加重率差异无统计学意义（P＞0.05）；其中物理治疗组6个月病变缓解率低于LEEP组（P＜0.05），但12个月病变缓解率差异不大；物理治疗组12个月复查，病变复发率明显高于LEEP组（P＜0.05）。姜华［18］选取妇产科门诊经病理学诊断为LSIL的妇女，并按照HR-HPV检测结果和患者个人意愿，分为单纯随访组和物理治疗组，定期随访TCT和HR-HPV，经 6、12、24 个月随访，发现 HR-HPV（-）组无疾病进展病例；HR-HPV（+）组疾病进展4例，物理治疗组疾病进展 1例；HR-HPV（-）组与 HR-HPV（+）组的疾病转归率差异有统计学意义（P＜0.01）。因此，在HPV阴性的LSIL随访中，应重视隐性HPV感染。病毒可能整合在宫颈细胞DNA内，但临床检测阴性而误为HPV阴性，其可能快速发展为HSIL。

5 HPV的疫苗

5.1 预防性疫苗

大量实验室和临床研究数据表明，HPV宿主的免疫反应对控制HPV感染和相关病变有重要作用［21-23］，HPV癌前病变和宫颈癌患者体内普遍存在对HPV的低免疫状态。HPV预防性疫苗主要以具有天然空间结构的合成L1蛋白病毒样颗粒为靶抗原，诱发机体产生高滴度的血清中和性抗体，以中和病毒，并协助肿瘤特异性杀伤T淋巴细胞清除病毒感染。目前，全球上市的HPV预防性疫苗有3种，即二价疫苗Cervarix、四价疫苗Gardasil和九价疫苗Gardasil 9。二价疫苗之所以被称作二价疫苗，是因其由两种类型HPV（16、18型）身上的L1蛋白组成的病毒样颗粒，这种蛋白不能自我复制，无法进一步感染活细胞，较安全。四价疫苗则是拥有HPV16、18、6、11型L1蛋白的颗粒；九价疫苗则包含 HPV16、18、6、11、31、33、45、52、58 型在内的9种L1蛋白颗粒。2017年7月、11月，二价、四价HPV疫苗分别在中国大陆上市销售，而九价HPV疫苗尚未在中国大陆正式上市。

从临床效果看，九价疫苗和四价疫苗相比，可增加对10%的HPV相关肿瘤和15%宫颈癌的预防，与二价疫苗相比，还可增加90%生殖器疣的预防［24-25］。理论上九价疫苗效果更好，预防范围更广泛。但目前能注射九价疫苗的地区较少，中国大陆地区尚未批准上市。同时，在HPV中，最高危的是HPV16、18型，而二价疫苗即可对两者起到很好的预防作用。接种HPV疫苗后可能有轻度、一过性局部反应,如红肿和疼痛。HPV疫苗不宜用于对其他疫苗有严重过敏史者或孕期女性，急性病患者应推迟接种。尽管HPV疫苗并不增加接种后晕厥的风险，但疫苗上市后调查报告显示，青春期女性在接种该疫苗后发生晕厥的概率较高，因此推荐注射疫苗后观察15 min。

公众的认知与接受度对疫苗的推广至关重要，因此要加强相关健康知识教育，提升公众对HPV疫苗的接受程度。预防性HPV疫苗的问世具有里程碑式的意义，是医学和公共卫生领域的重大突破，改变了半个多世纪以来形成的以二级预防（宫颈癌筛查）为主的宫颈癌预防模式，使宫颈癌一级预防（疫苗接种）成为现实，将促成全新宫颈癌预防体系的构建。

5.2 治疗性疫苗

HPV治疗性疫苗主要针对已感染HPV的患者，疫苗以模仿HPV病毒外壳起作用，其类型有病毒/细菌载体疫苗、肽疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗、细胞疫苗等。治疗性HPV疫苗相对于已上市的HPV预防性疫苗进展缓慢，目前重组蛋白疫苗、多肽疫苗已进入Ⅰ期临床试验，且显示出很好的疗效［26］。但治疗性疫苗免疫机制尚不清楚，推测主要是对机体自身免疫调控及清除HPV感染细胞或转化的瘤细胞。HPV相关的肿瘤为肿瘤治疗研究提供了很好的模型，相信随着研究的深入，定能研制出有效的HPV治疗性疫苗。预防性疫苗对已感染HPV患者的治疗效果有限，而治疗性疫苗则可通过激活细胞免疫特异性地清除病毒和被病毒感染的细胞，有望成为治疗HPV感染宫颈癌的新手段［27-28］。

综上，HPV感染是宫颈癌发生的必要条件之一，如何治疗HPV感染是困扰临床医生的难题，而治疗HPV感染是宫颈癌防治的重要环节，因此加深对HPV感染相关问题的认识，具有深远的临床意义。