抗结核药物基因组学研究进展

申晨 申阿东

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的传染性疾病，我国是TB高负担国家[1]。目前，TB主要依靠化学药物治疗。由于人类基因组存在个体化差异，不同个体对药物的反应不同。药物基因组学(pharmacogenomics)是研究基因组或基因变异对药物在人体内吸收、代谢、疗效及不良反应产生影响的现象及其机制，从而指导新药开发和合理用药的一门学科[2]。抗结核药物基因组学(anti-tuberculosis pharmacogenomics)以提高抗结核药物疗效及安全性为目标，致力于服务于抗结核药物的合理化给药、减少药物不良反应。抗结核药物基因组学研究主要关注药物基因组学在抗结核治疗中的应用，研究不同个体在抗结核药物治疗中包括药物吸收、转运、代谢、清除等在内的整个药物代谢过程的差异性，以及由此导致不同个体用药后的药效和药物不良反应产生差异性的遗传学基础[3-5]。

目前，WHO[6]推荐用于对抗结核药物敏感的TB化疗的一线药物主要包括异烟肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampin，RFP)为代表的利福霉素类(rifamycin)，以及乙胺丁醇(ethambutol，EMB)和吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)。用于耐药TB的治疗药物包括氟喹诺酮类[左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)、加替沙星(gatifloxacin，Gfx)]、二线注射剂[阿米卡星(amikacin，Am)、卷曲霉素(capreomycin，Cm)、卡那霉素(kanamycin，Km)、链霉素(streptomycin，Sm)]、其他核心二线药物[乙硫异烟胺(ethionamide， Eto)、丙硫异烟胺(prothionamide， Pto))、环丝氨酸(cycloserine，Cs)、特立齐酮 (terizidone，Trd)、利奈唑胺(linezolid，Lzd)、氯法齐明(clofazimi，Cfz)]等。抗结核药物的组织穿透性、药物与药物的相互作用及其代谢的个体差异性部分由编码药物代谢或运输相关通路基因的遗传学变异所导致，遗传决定的个体差异性在个体化治疗方案的定制中起着关键作用。通过鉴定与抗结核药物代谢相关的关键基因位点、研发能够用于判断抗结核药物疗效和不良反应的基因诊断技术，并以此为平台开发基因诊断试剂盒，有助于TB个体化抗结核药物种类和剂量的选择，为个体化治疗铺平道理。此外，开展抗结核药物基因组学研究有助于为新型抗结核药物的研发提供依据。

人类基因组学研究方法

一、候选基因位点测定

通常情况下，候选基因位点的确定主要依据已报道的相关基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)或突变(mutation)或纳入相关通路基因的SNP位点。在锁定目的基因位点并调取基因序列的基础上，运用聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态性方法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)[7]、PCR结合一代测序方法[8-10]、引物特异性实时定量PCR方法或多重PCR方法[9]、飞行质谱方法[11]、基因SNP定制芯片方法[12-13]等进行候选基因位点的测定。

二、全基因组关联分析

伴随全基因组SNP芯片技术的发展和普及，全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)得到了较为广泛的应用，有助于更全面地寻找抗结核药物代谢相关的基因多态性位点[13]。

三、高通量测序技术

目前，伴随二代和三代测序技术的研发，全外显子测序、全基因组测序在内的高通量测序技术已经在众多领域得到应用。二代测序技术已经应用在分枝杆菌的鉴定和分型中[14]。其在抗结核药物基因组学的应用将有助于更为全面地揭示抗结核药物相关遗传学位点。

药物基因组学与抗结核药物代谢

目前，药物基因组学在抗结核药物浓度的相关性研究主要集中在一线抗结核药物。药物基因组学在INH代谢中起着重要作用，其在 RFP代谢中的作用也有较多关注[15]，而在其他抗结核药物代谢中的作用报道相对较少。

一、 药物基因组学与INH代谢

INH是重要的一线抗结核药物，是50多年前报道的代谢个体差异的首批药物之一，目前广泛应用于TB和潜伏结核感染的治疗。INH主要通过N-乙酰转移酶2(NAT2)进行乙酰化失活代谢，INH的消除速率取决于NAT2的乙酰化代谢速率，而NAT2的乙酰化活性主要由其基因型决定[3,16]。基于NAT2基因型，患者可表现为慢乙酰化代谢(纯合突变等位基因)，中间代谢(NAT2*4杂合型)和快乙酰化代谢(NAT2*4野生纯合型)，这些代谢差异与母体化合物及其主要代谢物的不同血清等体液水平有关。快乙酰化代谢型治疗失败的风险较高，而慢乙酰化代谢型致肝损伤的风险较高。慢乙酰化等位基因频率在不同人群有所不同：在因纽特人、日本人和中国人约为10%，南印度人约为60%，中东地区约为90%，美国约为72%[3]。

Parkin等[17]观察了不同NAT2基因型个体间代谢INH的差异性，慢乙酰化个体的INH血清浓度相对其他个体(快乙酰化和中等乙酰化)增高4到6倍，并基于此提出了INH的个体化给药方案。类似地，一项研究比较了患者和健康志愿者尿液中INH的排泄，结果显示具有较高活性NAT2等位基因的受试者INH乙酰化水平较高[18]。Verhagen等[19]的研究发现约有17%、43%和40%的委内瑞拉儿童的基因型分别与快速、中等和慢乙酰化状态有关。慢乙酰化、中等乙酰化和快乙酰化基因型个体之间药代动力学(phararmacokinetics，PK)参数差异有统计学意义，而在快速和中等乙酰化代谢状态的儿童中观察到PK参数差异没有统计学意义。南印度的一项研究表明，2 h INH的血药浓度在慢、中间和快乙酰化代谢中差异有统计学意义(P=0.021)，其峰浓度(Cmax)分别为11.9、10.0和6.9 μg/ml[20]。 一项基于基因位点指导的INH个体化给药使更多患者达到了有效治疗剂量[21]。

二、药物基因组学与利福霉素类药物的代谢

以RFP为代表的利福霉素类抗生素是大环内酯类抗生素，是重要的一线药抗结核药物之一，在体外和体内条件下对MTB呈现浓度依赖的杀伤活性；除RFP外，常见的利福霉素还包括利福布汀(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)和利福定(rifadin)等[22-23]。

转运蛋白对利福霉素在人体中的转运和代谢中起着重要作用。RFP是由三磷酸腺苷结合盒式结构转运蛋白超家族成员B1(ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1)基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和由SLCO1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1)基因编码的有机阴离子转运肽1B1(organic anion transporter polypeptide 1B1，OATP1B1)的底物[4]。此外，催化RFP进行脱乙酰化代谢的羧酸酯酶2(carboxylesterase，CES2)、能够转录调节药物转运体的孕烷X受体(nuclear receptor subfamily 1 group I member 2，NR1I2)和组成性雄激素受体(Ig-like cell adhesion molecule，CXADR)也被认为可能参与了RFP在体内的代谢。

(一)SLCO1B1基因多态性与利福霉素类药物

SLCO1B1基因的rs4149032多态性位点：Weiner 等[4]开展的一项来自北美、非洲和西班牙的包括72例成人肺结核患者的药代动力学研究探讨了接受标准治疗剂量的TB患者体内的RFP代谢差异性与ABCB1 c.3435C>T、SLCO1B1 c.11187G>A、SLCO1B1 c.388A>G、SLCO1B1 c.463C>T、SLCO1B1 521T>C、SLCO1B1 c.1463G>C和SLCO1B3 c.334T>G基因多态性之间的关系。该项研究首次报道了RFP代谢与SLCO1B1 rs4149032(c.463 C>T)基因多态性之间存在相关性。该研究比较了TB患者和健康受试者之间，不同地区间及不同种族之间在RFP药代动力学的差异，结果显示SLCO1B1基因多态性对RFP生物利用度有显著影响，SLCO1B1 rs4149032 CT杂合变异基因型比CC野生基因型低36%(29.8，P=0.001)。Chigutsa等[5]对南非TB患者进行的一项研究进一步发现：SLCO1B1基因rs4149032 T等位基因在非洲黑人中频率较高，携带该稀有等位基因的杂合和纯合基因型个体对RFP的生物利用率相对野生基因型个体分别降低了18%和28%。模拟数据显示，当携带有稀有等位基因的TB患者所使用的每日RFP剂量增加150 mg(增加原剂量的30%)后，其血浆RFP水平能够与野生基因型个体相似，并能够使Cmax低于8 mg/L的患者比例从63%降至31%。这项研究表明，有必要对SLCO1B1 rs4149032 A等位基因携带患者增加RFP给药剂量。与此不同，一项来自坦桑尼亚的研究[24](rs4149032)和一项来自南印度的研究[25]均没有观察到SLCO1B1基因型(rs11045819、rs4149032和rs4149033)能够影响RFP的代谢。根据千人基因组计划的数据，rs4149032稀有等位基因在中国汉族人群(HAPMAP-CHB)中的频率为36.6%，略高于非洲人群。因此，有必要在中国人群中探讨SLCO1B1 rs4149032多态性在影响RFP血浆浓度及其对TB治疗结局的影响。

(二)CES2基因多态性与利福霉素类药物

CES2对RFP进行脱乙酰化反应形成25-脱乙酰RFP，CES2基因多态性能够显著影响RFP的血浆浓度。 Song等[26]对35例接受一线抗结核药物治疗的肺结核患者测定RFP和25-脱乙酰RFP的血浆浓度，并采用覆盖全部12个外显子、内含子和启动子区域的CES2基因的PCR测序方法探讨了CES2基因变异与RFP代谢的关系；同时，进行双荧光素酶报告基因检测以评估启动子区域的变异是否影响该基因的转录。结果显示三种高度连锁的变异(c.-2263A>G，c.269-965A>G和c.1612-136G>A)和c.1872*302_304delGAA的基因型与血浆RFP浓度显著相关。RFP平均血浆浓度随着3个连锁变异的突变等位基因的携带个数增多而显着增加，而随着c.1872*302_304delGAA突变型等位基因数量的增加而减少；并且启动子区域的c.-2263A>G可能通过影响CES2基因表达改变RFP代谢。

(三)ABCB1、NR1I2和CXADR基因多态性与利福霉素类药物

Weiner等[4]开展的一项研究中，同时观察了ABCB1基因多态性在北美、西班牙和非洲不同地区成人肺结核患者中的作用；然而，该研究未明确其基因变异与RFP代谢的相关性。此外，Chigutsa等[5]对南非TB患者进行的一项研究也未发现ABCB1多态性与RFP代谢的相关性，由于RFP既是ABCB1基因编码的P糖蛋白的底物又可被RFP诱导，因此可能需要更多的研究来明确其对药物转运和细胞内积累的影响。此外，Chigutsa 等[5]也没有发现NR1I2和CXADR多态性对RMP 代谢有任何显著影响。

三、药物基因组学与乙胺丁醇

目前，一部分药物基因组学研究关注了一线抗结核药物EMB。2016年，Fatiguso 等[27]对ABCB1、OATP1B1、CXADR、维生素D受体(VDR)及细胞色素P450家族(CYP24A1和CYP27B1)基因的SNPs和EMB血浆和细胞内浓度相关性的研究发现ABCB1、CYP24A1和VDR基因的SNPs与血浆与细胞内EMB浓度之间有相关性，但尚需要在多种族和大样本中进一步验证。

四、 药物基因组学在其他抗结核药物代谢中的研究

目前，随着MTB对一线抗结核药物耐药率的增高，非一线抗结核药物在TB治疗中的应用呈现增多的趋势, 对这些药物进行药物基因组学研究有助于指导临床合理用药。有研究已经报道了ABCB1、UGT1A和SLCO1B1基因多态性对莫西沙星药代动力学的影响： Naidoo等[28]的研究显示，转运蛋白基因UGT1A的rs8175347TA5/6基因型相比TA6/6、 6/7、 7/7 和7/8基因型能够降低莫西沙星20.6% 的药物清除率，rs3755319位点的AC和AA基因型相比CC基因型能够降低莫西沙星11.6%的药物清除率；编码转运蛋白P-gp的编码基因ABCB1的rs2032582多态性与莫西沙星药代动力学参数的变化显著相关，稀有基因型可使莫西沙星生物利用度降低40%。而Weiner等[29]发现，ABCB1 基因中的rs1045642多态性位点不影响个体对莫西沙星的代谢能力，并由此认为P-gp似乎不是莫西沙星代谢的主要决定因素。Weiner 等[30]发现，SLCO1B1的rs4149015AG稀有基因型相对GG野生基因型能显著增加莫西沙星0～24 h的药时曲线下面积(AUC0～24)和最大清除率。然而，遗传变异对莫西沙星药代动力学的相关性需要更多的研究数据，尤其是中国人群中研究数据的支持。

药物基因组学与抗结核药物致肝损伤

目前，INH是公认的导致TB治疗中发生肝损伤(anti-TB drugs induced liver injury, ATDILI)的主要抗结核药物，NAT2对INH消除速率的降低是导致INH毒性旁路代谢产物增高引发肝损伤的主要原因。INH在常规剂量时不良反应较少：肝毒性是TB治疗中最常见和最严重的不良反应，另一种不良事件是周围神经病，通常在高剂量时发生，特别是在慢乙酰化代谢个体中；这些不良反应与患者INH的毒性代谢物乙酰肼的清除能力较低有关并可通过吡哆醇合并给药进行预防[31-32]。慢乙酰化更容易发生INH药物诱导的肝损伤[33-34]及周围神经病[35]，而快乙酰化应用标准剂量疗效较差[36]，可能需要调整剂量到目前推荐剂量的1.5倍[37]。 Wang等[38]针对来自包括474例患者和1446例对照在内的14项研究的荟萃分析显示，NAT2慢乙酰化代谢与抗结核药物引起的肝毒性风险之间存在显著相关性。一项基因型指导的随机对照试验研究了172例日本肺结核患者的治疗失败率和INH引起的肝损伤[36]：基因型指导剂量组的患者根据其乙酰化状态分别接受2.5、5.0和7.5 mg/kg INH，而标准剂量组分别接受约5 mg/kg。 标准治疗组中有78%的慢乙酰化代谢个体发生肝损伤，而采用基因型指导剂量组的慢乙酰化代谢个体均未经历肝损伤或早期治疗失败。

此外，细胞色素氧化酶P450(cytochrome P450 oxidase, CYP2E1)作为Ⅰ相代谢酶、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)作为Ⅱ相解毒酶，以及SLCO1B1和ABCB1分别作为重要的肝脏摄取和外排转运体，其基因多态性与ATDILT易感之间的相关性也被探讨，尽管尚未明确[9,39]。

2014年Singla 等[9]针对ATDILI的病例-对照研究表明，CYP2E1基因的杂合基因型′c1c2′是增加ATDILI风险的重要因素。′c2′等位基因缺失可被认为是女性对抗ATDILT 的保护因子。在男性中，“c1c2”等位基因的存在被认为是ATDILI风险增加的原因。2011年向阳等[40]采用Meta分析的方法,对国内外公开发表的有关CYP2E1基因多态性与ATDILI易感性的关系的研究文献进行再分析，纳入国内外研究文献5篇，累计肝损伤组194例，对照组639例；发现CYP2E1c1/c1基因型与ATDILT易感性关系之间的合并OR值为1.86(95%CI=0.95～3.66)，排除1篇研究对象为儿童的文献，合并OR值为2.22(95%CI=1.51～3.26)。因此认为，尽管ATDILI的易感性与CYP2E1基因多态性没有相关性，但CYP2E1c1/c1基因型TB患者发生肝损害的危险性可能会增加。最近，武鑫等[41]纳入2000年1月1日至2016年10月31日研究中国人群CYP2E1基因多态性与ATDILI风险关系的8篇文献进行了Meta分析，结果显示CYP2E1c1/c1与ATDILI风险相关(OR=1.32；95%CI=0.93～1.89)； NAT2慢乙酰化表型与ATDILI风险相关(OR=2.57；95%CI=1.77～3.71)；NAT2慢乙酰化表型联合CYP2E1 c1/c1与ATDILI相关(OR=3.53；95%CI=2.05～6.07)。最终得出结论：中国人群中NAT2慢乙酰化表型可以增加ATDILI的发生风险，虽然CYP2E1c1/c1与ATDILT之间关系无统计学意义，但当其与NAT2慢乙酰化表型同时存在时更易导致ATDILI的发生。

2014年Singla 等[9]研究发现，GSTM1和GSTT1双重失活基因型与ATDILT发生有关。此外，Li 等[42]通过2012年10月以前发布的12项针对GSTM1(包括951例ATDILI病例，1922例对照)和13项针对GSTT1(847例ATDILI患者，1811例对照)的病例-对照研究显示，GSTM1无效基因型增加了ATDILI风险(OR=1.36；95%CI=1.04～1.79)相关，但GSTT1多态性与ATDILI的风险未见相关(OR=0.98；95%CI=0.82～1.18)。2011年朱冬林等[43]应用多重PCR技术检测抗结核药物治疗后发生肝损伤的228例TB患者及300例未发生肝损伤的TB患者的GSTM1和GSTT1基因多态性。其结果显示，病例组与对照组GSTM1基因缺失型频率差异无统计学意义，GSTT1基因缺失型频率差异也无统计学意义。Liu等[44]在平均年龄4.7岁(2个月到14.1岁)的163例儿童TB(20例ATDILI和143例对照)群体中的一项研究显示，GSTM1和GSTT1基因多态性均与ATDILI的发生差异无显著相关性。最近，祖丽娅·沙塔尔等[45]采用多重PCR检测2791例肺结核患者的GSTM1和GSTT1基因多态性与治疗2个月时发生ATDILI的相关性，发现GSTM1基因型是ATDILI发生的影响因素，单纯具有GSTM1缺失基因型和同时具有GSTM1、GSTT1缺失基因型是ATDILI发生的影响因素。

除外INH导致的肝损伤，尚有研究探讨RFP所诱导肝损伤的遗传学机制。有研究表明，SLCO1B1的两种常见的非同义突变 rs2306283(c. 388A>G)和rs4149056(c. 521T>C)多态性位点处于部分连锁不平衡状态，形成4种重要的单倍型：SLCO1B1 * 1A(无突变等位基因)、SLCO1B1 * 1B(rs2306238/c.388A>G)、SLCO1B1 * 5(rs4149056/c.521T>C)和SLCO1B1*15(包含两种变异)，随后的另一研究显示SLCO1B1 * 15单体型与中国人群中RFP诱导的肝损伤有关，可能在胆汁淤积/混合性损伤中发挥作用[46-47]。

目前，高通量的多候选基因位点[12]和全基因组关联研究(GWAS)[13]已经被应用到ATDILI易感性的研究中。例如，2016年，Petros等[13]使用Illumina Omni Express Exome芯片对48例抗结核药物治疗所致肝损伤患者和354例无肝损伤对照进行全基因组基因分型(GWAS研究)，鉴定出与埃塞俄比亚患者ATDILI风险相关的遗传变异。其结果显示，位于第6号染色体RIPOR2(RHO family interacting cell polarization regulator 2)基因内含子中的SNPrs10946737与ATDILI最为相关(P=4.4×10-6，OR=3.4,95%置信区间=2.2～5.3)。

药物基因组学与MTB耐药

目前，国内外对耐药TB呈现出较多的关注。TB耐药的主要原因被认为是MTB发生了耐药突变。而MTB发生突变的原因通常从患者依从性差、耐药菌株的传播等角度进行探讨，但也有研究提示患者对药物代谢的个体差异性也是导致耐药的一个因素[48-49]。

目前药物基因组学在MTB耐药领域的研究涉及较少。2012年，Pasipanodya等[49]对13项成人TB的随机对照研究进行的荟萃分析发现，NAT2快乙酰化患者应用INH进行抗结核治疗的失败率和MTB的获得性耐药率高于NAT2慢乙酰化患者。此外，有两项研究关注了ABCB1基因多态性对耐药TB发生的意义，发现ABCB1基因rs2032582A等位基因携带表现出增高的抗结核药物抵抗[50-51]。药物基因组学在该领域相关研究的开展有助于进一步明确导致TB临床耐药的机制。

抗结核药物基因组学研究的挑战

通过以上分析，笔者发现，抗结核药物基因组学研究目前主要从以下三方面入手。第一，从血药浓度(包括原药浓度及其各阶段代谢产物)的动态变化的角度研究基因组序列与抗结核药代动力学，这是最为直接的方法。第二，由于药物毒性反应通常是毒性代谢产物在体内聚集的表现，因此还可以从毒性反应角度入手研究基因组序列与ATDILI等不良反应。第三，在血药浓度的基础上结合抗结核治疗的疗效(患者的症状与体征的好转、治疗疗程的长短等)进行药物基因组学研究。

不难发现，抗结核药物基因组学研究目前仍存在很多值得注意的问题。笔者在文中列举了同一基因位点变异对药物代谢的影响在不同研究中所得出的研究结论不一致、同一基因位点在不同人群中与肝毒性的相关性不一致等文献报道。笔者认为，导致这些不一致性的原因必然是多方面的。药物的吸收、分布和代谢具有十分复杂的调控机制，众多基因位点必然协同发挥调控作用，不同人群间具有的遗传异质性，同时，年龄、性别和疾病状态也能够参与调控。由于不同研究所纳入的研究对照存在民族、地域、年龄和疾病轻重等众多差异性，且所选取的检测基因位点和实验方法也不尽相同，因此研究者应该针对遗传背景较为一致的目的人群，在具有相似遗传背景且临床资料翔实的大样本中进行相关研究，并对基因位点间的交互作用进行合并分析。

尽管一些研究认为根据基因型调整用药具有很好的应用价值[21, 36, 52]，由于不同种族具有遗传差异性，不同种族之间的给药剂量模型不能直接照搬。当尝试给出个体化用药公式时，年龄、体质量、肝功能、肾功能、合并用药等变量也应作为参数进行优化。考虑到存在大量基因和众多位点协同发挥作用，因此如何有效纳入和进行交互，还依赖于大数据和智能算法的运用。

目前，药物基因组学INH和RFP等主要的一线抗结核药物中的研究数据较多，而在其他抗结核药物代谢中的研究相对较少[53-54]。非一线抗结核药物在药物代谢、药物不良反应方面同样面临挑战，例如线粒体DNA的12S rRNA基因A1555G或C1494T这两个稀有等位基因位点是氨基糖苷类抗生素治疗耐药结核病时引发感音神经性耳聋的罪魁祸首[55]。此外，在抗结核药物的研发领域，许多潜在抗结核药物已经陆续进入了临床试验阶段：例如唑烷酮类、咪唑并吡啶、乙二胺、苯并噻嗪酮、硝基咪、高铁霉素、亚甲基吩嗪等药物已经进入Ⅰ期或Ⅱ期临床研究[56]。可见，伴随诸多新药在TB治疗中的应用，抗结核药物基因组学的挑战还将持续存在。