脂肪干细胞来源外泌体促进组织修复的应用进展

陈筑昕 综述 周双白 李青峰 审校

【提要】 脂肪干细胞具有促进组织修复再生的作用，作用机制与其旁分泌作用密不可分。外泌体是一种细胞分泌的外囊泡结构，是细胞之间通讯的新机制。近年的研究发现，干细胞来源外泌体是干细胞旁分泌活动的一种重要方式，介导其促进组织再生。外泌体的应用为组织修复提供了一种新策略，本文对脂肪干细胞来源外泌体应用于组织修复的研究进展进行综述。

细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs），是机体内细胞经胞吞作用形成多泡小体后，通过细胞膜融合分泌到细胞外环境中的微小囊泡[1]。根据囊泡直径大小，可将EVs分为三类：凋亡小体（＞1 000 nm）、微囊泡（100～1 000 nm）、外泌体（Exosome，30～100 nm）。 EVs可从干细胞等多种细胞中释放，也可被多种细胞摄入，含有与母细胞相似的生物活性物质，包括RNA、DNA、蛋白质、脂质及完整的细胞器（如线粒体）等。其中，外泌体可参与调控机体正常生理功能和异常病理过程，被认为是细胞之间通讯的新机制[2]。脂肪干细胞（ADSCs）具有和骨髓间充质干细胞（BMSCs）相似的表面标记、基因表达谱和生物学功能[3-5]。但目前干细胞发挥作用的机制尚不明确。近年来的研究表明，干细胞所发挥的组织修复与再生功能，不仅因其在损伤部位的增殖和分化，很大程度上是由其旁分泌作用实现的[4-5]。ADSCs可分泌直径20～100 nm的脂质双层膜包裹结构的亚细胞颗粒，称为脂肪干细胞来源外泌体（Adipose stem cells derived exosome，ADSCs-exo）。ADSCs-exo与ADSCs相比，具有更多的优势：性质更稳定，易于保存，便于管理及运输；不含活细胞，是无细胞治疗的基础；生物学功能不随时间延长而衰减；低抗原性，同种异体应用不会引起免疫反应[6]。

因此，目前广泛开展了对外泌体的成分、形成机制、作用机制和功能的研究。本文将对ADSCs-exo与组织修复相关的最新研究进展、潜在分子机制及其未来发展方向进行综述。

1 外泌体的生物学特性及功能

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程形成的直径30～100 nm、密度为1.13～1.19 g/mL的膜性脂质囊泡，透射电镜下观察具有典型的“杯口状”形态，几乎所有细胞类型在各种生理和病理条件下分泌[7]，内含有功能性蛋白质、mRNA及microRNA等物质，在细胞间的信息传递过程中发挥重要作用。

研究表明，不同来源的外泌体蛋白既有共同之处也有特异性[8]。外泌体所含的共同蛋白与其形成过程有关，这些蛋白来自分泌细胞膜及高尔基体和内质网的生物膜等。有与细胞骨架组成相关的分子：四次跨膜蛋白超家族 （如CD63、CD9和 CD81），热休克蛋白（HSP70、HSP90）等，这些蛋白在帮助外泌体进出细胞过程中发挥重要作用，也因为这些蛋白的保守型，将其作为表面标记来鉴定体外分离得到的外泌体。在特异性方面，病理状态下细胞释放的外泌体与正常状态下细胞释放的外泌体是存在差异的[9]。研究显示，人类免疫缺陷病毒感染后的T淋巴细胞和EB病毒感染后的B淋巴细胞释放的外泌体内含有病毒编码物质，其机制暂时未被阐明，但可能与病理状态下细胞的高代谢活性相关[10]。

过去认为外泌体是细胞处理的冗余细胞成分，但越来越多的研究证明，外泌体通过细胞间转移核酸、蛋白质、脂质的特定物质，参与机体的各种生理或病理的过程，如抗原呈递免疫反应、肿瘤转移、蛋白清除、基因交换等[11-12]。外泌体进入靶细胞的途径有三种：通过靶细胞胞吞作用被摄入到细胞内；通过细胞膜融合的方式与靶细胞膜融合，直接释放其中含有的物质及信息到靶细胞；通过膜表面与靶细胞膜表面的受体-配体高效率的结合，将细胞外信号传递到细胞内，从而进行信息交流。最新研究表明，外泌体还可作为载体将抗肿瘤药物紫杉醇包被，并靶向递送至肿瘤细胞，从而提高化疗药物紫杉醇对耐药肿瘤细胞的治疗效果[13]，药物经外泌体包封后药代动力学发生了变化，药物在体内的半衰期延长，毒副作用减少，治疗效果得到提高[14]。

2 间充质干细胞来源外泌体在组织修复中的相关研究

外泌体不仅体现来源细胞的分化方向，还体现来源细胞的生理病理状态，是因为其所含的miRNA是细胞间交流的主要调节物质，能够通过自身的降解和再表达来调节受体细胞的基因表达。细胞中RNA的表达谱特征不具有供体和组织特异性，然而外泌体中所含的RNA却较大程度地受细胞类型和分化状态的影响，不同组织来源的外泌体具有不同的性能。间充质干细胞来源外泌体 （Mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-exo）中的RNA或者蛋白能够发挥细胞归巢作用，并调节细胞的增殖与分化，可以限制损伤、调节免疫反应以及促进细胞损伤后的自我修复和组织再生[15-17]。Baglio等[16]分离由人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体，并通过电子显微镜标记、蛋白分析、RNA测序等方法，证实人骨髓和脂肪间充质干细胞分泌的外泌体富含特异性miRNA和tRNA。Quesemberry等[18]提出，MSC-exo扮演着干细胞生物学上的关键角色，推测外泌体在免疫调节、促血管形成及促进细胞新生方面有重要作用。

2.1 免疫调节

Zou等[19]发现，MSC-exo可降低巨噬细胞趋化蛋白CX3CL1及肿瘤坏死因子（TNF）的表达，同时上调白细胞介素-10，降低局部炎症反应，起到免疫调节的作用。Kordelas等[20]的研究表明，MSC-exo可降低难治性抗移植物抗宿主病患者体内的白介素-1β、TNF-α及γ-干扰素水平，调节机体免疫，促进受损组织修复。

2.2 促血管新生

研究证明，来自内皮祖细胞的外泌体，携带有促血管生成的miRNA（如 miR-126、miR-296和let-7等），能够在静止的内皮细胞中通过水平转移RNA激活血管形成[21-22]。将MSC外泌体与血管内皮细胞体外共培养，MSC-exo可被血管内皮细胞摄取并内化，RT-PCR发现培养后的血管内皮细胞同样高表达MSC-exo携带的促血管化miRNA[23]。人脐带MSC-exo与体外培养的人脐静脉内皮细胞共培养时，内皮细胞成管状结构更加明显，内皮细胞迁移更加良好[24]。

2.3 促进细胞增殖、抑制细胞凋亡

在甘油诱导的严重联合免疫缺陷 （Severe combined immune deficiency，SCID）鼠急性肾损伤模型中发现，骨髓MSC-exo具有保护肾功能的作用[25]，其修复能力与其母体细胞无显著性差异，可通过上调bcl-xl、bcl2、birc8等抗凋亡基因，下调Casp1、Casp8、LTA等促凋亡基因，同时活化细胞外信号调节激酶，以促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，从而发挥组织修复作用。此外，MSC-exo可通过向靶细胞转运RNA，诱导靶细胞合成肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等，激活信号通路，调控靶细胞的细胞周期活动，最终促进其增殖[26]。Ko等[27]的研究表明，静脉输注ADSCs-exo可抑制大鼠模型的肝癌细胞的生长，认为与NKT细胞有关。但是，孙昭等[28]认为，ADSCs-exo下调结肠癌细胞系HCT8上皮相关标志物的表达，上调间质相关标志物的表达，因而促进HCT8的迁移和侵袭。在乳腺癌细胞系迁移方面，ADSCs-exo也被认为可将Wnt信号通路激活，促进乳腺癌细胞系MCF7的迁移[29-30]。

3 ADSCs-exo应用于促进组织再生的研究进展

近年来发现，ADSCs-exo与ADSCs分泌的生长因子、趋化因子、脂质等多种活性物质近似，可能也具有相似的生物活性[31-33]，可促进血管内皮的增生。血小板衍生的生长因子可促进ADSCs释放增强血管生长潜力的外泌体[1]。

3.1 神经系统疾病的修复

魏俊吉等[34]用PC12细胞（鼠嗜铬细胞瘤细胞系）建立谷氨酸神经细胞损伤模型，用ADSCs-exo处理损伤细胞，结果显示外泌体中含有大量的对大脑损伤有一定保护作用的细胞因子（如胰岛素生长因子和肝细胞生长因子），能够提高损伤细胞的存活率，其作用机制可能是外泌体通过PI3K-Akt通路实现对神经损伤的保护作用。另有研究发现，ADSCs-exo能够携带高水平的脑啡肽酶，具有治疗阿尔兹海默病的潜能[35]。阿尔兹海默病一种神经退行性病变，其特征性表现是β-淀粉肽在脑中沉积，脑啡肽酶是脑中最重要的β-淀粉肽降解酶。ADSCs-exo与高表达β-淀粉肽的成神经细胞瘤细胞共培养时，能够降低细胞内、外的β-淀粉肽，表明ADSCs-exo有助于β-淀粉肽的清除。此外，ADSCs-exo释放一系列神经因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子和神经胶质衍生神经营养因子等，可促进神经元修复并刺激神经组织再生。Chen等[36]发现，ADSCs-exo的联合治疗可减少大鼠急性缺血性卒中的梗死面积，促进神经功能恢复。

3.2 心脏损伤修复

Cui等[37]的报道显示，ADSCs-exo可通过转运microRNA改善心肌缺血，显著降低因心肌缺血引起的心肌梗死，同时肌酸激酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）和心肌肌钙蛋白Ⅰ的水平降低。同时，ADSCs-exo拮抗心肌细胞凋亡，通过Bcl-2的上调和Bax的下调，对心脏功能产生保护作用。

3.3 肾损伤修复

Lin等[38]应用小鼠肾脏缺血再灌注模型，比较ADSCs、ADSCs-exo以及两者联合应用的效果，发现单独应用外泌体即可减轻肾缺血再灌注损伤，两者联合应用比单独应用干细胞更能减轻肾脏功能的恶化和保护肾结构的完整性，并认为外泌体能转运特殊的mRNA分子，激活AKt及ERK信号通路，抑制凋亡基因Bax、Caspase3/7的表达并激活细胞幸存信号，使Bcl－2表达上调，从而促进肾脏细胞增殖。

3.4 骨组织修复

Li等[39]报告了一种新型无细胞组织工程骨的构建和评估。他们将hADSCs的外泌体与PLGA支架结合，成功加速了小鼠颅骨缺陷的修复。他们将ADSCs-exo固定在聚多巴胺包被的PLGA/PDA支架上，研究ADSCs-exo对人骨髓干细胞的成骨、增殖和迁移能力的影响，并通过成骨诱导优化其骨诱导作用。体外实验表明，ADSCs-exo可以从PLGA/PDA支架上缓慢地持续释放；体内实验结果表明，这种无细胞体系显著增强了骨再生，在新形成的骨组织中至少部分通过其骨诱导作用和促进间充质干细胞迁移和归巢作用。种新型无细胞系统由ADSCs-exo和PLGA/PDA支架组成，为骨组织工程提供了新的研究思路，显示了修复骨缺损的潜力。宋子珺等[40]研究了ADSCs-exo对低氧缺血情况下骨细胞凋亡的影响。缺血是造成骨细胞凋亡的主要原因，低氧缺血环境协同促进骨细胞凋亡，ADSCs-exo可有效抑制低氧缺血环境诱导的骨细胞凋亡，提示ADSCs-exo可以促进骨组织修复与再生。Tofino-Vian等[41]指出，ADSCs-exo可以缓解骨关节炎的炎症刺激。ADSCs-exo下调白介素-1β，减少了炎症介质的产生，对白介素-6和前列腺素E2的影响最大，可以调节炎症和氧化应激，对异常成骨细胞代谢进行矫正，从而缓解骨关节炎。

3.5 皮肤及创面修复

Hu等[42]发现，ADSCs-exo能够以剂量依赖性的方式刺激成纤维细胞的增殖、迁移和胶原蛋白合成，并促进细胞周期蛋白1、N-钙黏蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和增殖细胞核抗原的表达，从而促进皮肤伤口的愈合。Kang等[43]进一步研究发现，ADSCs-exo通过传递miR-31促进内皮细胞的迁移和血管生成。其中的一个抗血管生成基因HIF-1，被认定是miR-31在血管内皮细胞的靶向基因。Liang等[44]研究表明，ADSCs-Exo可传输miR-125a到内皮细胞，降低血管生成抑制剂DLL4的表达，促进血管内皮尖端细胞的形成，调节内皮细胞血管生成作用。Pu等[45]认为，ADSCs-exo对缺血再灌注损伤的修复有明显作用，可促进皮瓣存活并增加毛细血管的密度。

4 总结与展望

ADSCs-exo促进组织修复和再生，主要是通过传递ADSCs来源或自身特异性包装的蛋白、脂质、mRNA和miRNA等物质，并介导旁分泌通路以及所需的营养因子和炎症因子，使损伤组织中的细胞重新进入细胞周期[46]。ADSCs-exo可以避免干细胞治疗的免疫排斥、伦理问题等缺点，且具有高稳定性、易于储存、无需增殖、便于定量使用等优势，与单一的细胞因子比较，具有较高的安全性和更大的组织再生潜能[6]。

目前，ADSCs-exo的研究尚在初期阶段，还需对ADSCsexo介导的促进组织再生治疗机制进行深入的研究。因此，未来对ADSCs-exo的研究将不仅仅关注其治疗潜能，更应对相关的安全性进行评估。

总之，随着对ADSCs-exo研究的深入，其在促进组织再生中的应用和机制将更清晰，在组织缺损和修复重建中具有巨大的临床应用前景。