过氧化物酶体增殖物激活受体γ激动剂对人结肠癌化疗敏感性的研究

臧亚丹

（同济大学，上海 200092）

恶性肿瘤中比较常见的一种是结肠癌，他的发病率在这些年里逐渐上升。目前结肠癌的治疗方法是以手术为主辅助结合化疗进行综合治疗。5-氟尿嘧啶5-F是结肠癌化疗方案的主要药物组成，如果5-氟尿嘧啶的用药量过少会无法达到正常的效果，用药量过多会使得胃肠道正常细胞与骨髓细胞的毒性增加。单独使用5-氟尿嘧啶的利用率仅有10%～30%。为了减少他的毒性，5-氟尿嘧啶会和其他化疗增敏剂等的要求一起使用。PPARγ激动剂罗格列酮是PPARγ的合成配体，和PPARγ很容易结合。本次实验研究里我们的研究对象为人结肠癌LOVO细胞，从细胞水平和动物水平分析罗格列酮对5-氟尿嘧啶的化疗增敏效果及其作用机制。

本论文实验包括如下几个阶段。

1 实验材料准备阶段

（1）实验动物：裸小鼠，雌性，5周龄左右，体质量20g左右，SPF级条件下饲养。

（2）细胞株：人结肠癌LOVO细胞株，在5% CO2、37℃ 环境下，在含有100 U/mL盘尼西林Penicillin、100 U/mL链霉素streptomycin、10%新生牛血清的Dulbecco's Modified Wagle Medium高糖培养基中培养结肠癌细胞。挑选出对数生长期细胞。

2 动物实验阶段

（1）荷瘤裸小鼠模型：肿瘤细胞移植的部位选在裸小鼠的后背右侧皮下。用生理盐水洗涤对数期生长的LOVO细胞，通过生理盐水重悬计数的办法，接种数量为5×106/只的LOVO细胞。

（2）实验分组：肿瘤细胞移植14天后，随机把荷瘤裸小鼠五只为一组，分成四组。分别是对照组、罗格列酮组、5-氟尿嘧啶组、和5-氟尿嘧啶&罗格列酮联合用药组。4组分别用纯生理盐水、5-氟尿嘧啶配制的生理盐水、罗格列酮配制的生理盐水、5-氟尿嘧啶和罗格列酮共同配制的生理盐水灌胃给药，连续14天。

（3）瘤体测量、体质量和数据处理：测定荷瘤裸小鼠瘤体最短径和最长径，并称量体质量，计算肿瘤体积，并计算抑瘤率。给药14天后把裸小鼠处死，取瘤块并称瘤质量。

3 细胞实验阶段

（1）四甲基偶氮唑盐法测定细胞增殖情况：在96孔培养板上接种对数期生长的细胞。在5% CO2、37℃孵育，考虑到分组的要求，各组采取不同处理因素，每一组设置五个复孔进行培养16～48小时，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL即0.5%四甲基偶氮唑盐，继续培养四小时后离心去除上清，每个孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡，等到甲臜完全溶解以后，用酶联免疫检测仪在波长490 nm处用酶标仪读取OD值，计算细胞存活率。

（2）细胞形态观察：在6孔培养板上接种取对数期生长的LOVO细胞，在细胞作用不同处理因素四十八小时，然后于荧光倒置显微镜下进行查看、摄片。

（3）染色并检测细胞核形态：用Hoechst 33342对结肠癌细胞标记，每孔加入荧光染料Hoechst 33342 1mL，在37℃下避光荧光染色20 min，染色充分后在荧光显微镜下进行查看、摄片。

（4）细胞周期分布检测：结肠癌细胞经5-氟尿嘧啶、罗格列酮及5-氟尿嘧啶&罗格列酮联合处理四十八小时后，把细胞收集起来，并用磷酸缓冲盐溶液进行洗涤，沉淀用事先冷却的浓度为70%的乙醇固定足够的时间。

（5）蛋白质印迹法检测细胞周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶2和细胞周期蛋白A1的表达：结肠癌细胞经罗格列酮或/和5-氟尿嘧啶处理四十八小时。RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）是细胞组织快速裂解液，用它把蛋白提取出来，使用BCA蛋白浓度检测法对提取出的蛋白浓度进行测定，使用12%分离胶将等量样品电泳分离，把蛋白转移到NC膜上，按步骤进行三次如下实验：封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、显影。

（6）统计分析：数据分析使用SPSS13.0统计软件（SPSS Inc，Chicago，IL，USA），进行方差分析及组间比较，当P＜0.05可以认为有统计学意义的显著差异。

实验表明，罗格列酮能够增强5-氟尿嘧啶对人结肠癌结肠癌细胞的生长抑制作用，这种作用与其促进细胞凋亡以及细胞S期周期阻滞有关，本研究可为临床上抗肿瘤药物的研发提供了理论依据。

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