缺氧与脑胶质细胞瘤的抗血管治疗耐药机制

陈石蕊 李金城 李子超 薛小燕 章薇 毛星刚* 章翔*

(第四军医大学: 1西京医院神经外科; 2学员队三大队一中队;3学员队二大队二中队;4药学系药理学教研室，陕西 西安 710032)

多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成人中最常见的原发恶性脑肿瘤，其中位生存期仅为1年左右[1]。丰富的血管发生及浸润生长是GBM的典型病理特点，也是其手术难以完全切除、容易复发的因素[2]。目前除公认的化疗药物替莫唑胺(temozolomide, TMZ)外，近年来唯一获得FDA批准使用脑胶质瘤治疗的抗血管药物为贝伐单抗(Bevacizumab, BEV)[3]。BEV是重组的人源化血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)单克隆抗体。目前研究认为，VEGF是作用最为明显的血管生长因子。GBM具有丰富的血管结构，其VEGF的表达水平较低级别胶质瘤高出了约10倍，且其表达水平与肿瘤恶性程度及预后密切相关。由于VEGF同时具有抑制血管生成和水肿的作用，成为抗血管治疗一个极具前景的靶点。抗血管药物在多种实体瘤的治疗中取得了一定的临床疗效。然而，抗血管治疗尚存在争议，其最大的问题是可导致肿瘤耐药及浸润性进展[4]。多数GBM患者经抗血管治疗后可有短暂的临床缓解期，但最后出现肿瘤进展、耐药，以致抗血管治疗失败。

GBM有原发和继发性之分。原发性GBM生长迅速，通常不伴有IDH1突变；而继发性GBM则生长缓慢，一般从低级别星形胶质细胞瘤进展而来，常伴有IDH1突变。原发和继发性GBM具有相同的病理组织学特点，包括明显的细胞增殖、异型性、核分裂、坏死并常伴有伪栅栏样结构(pseudopalisades)、丰富的异常血管结构等。GBM肿瘤细胞最初在正常血管附近聚集，以获得其生长所需的氧和营养物质。然而，随着肿瘤迅速增殖，GBM细胞可破坏其周围血管的完整性。血管的破坏导致瘤组织局部缺氧；另一方面，瘤细胞的快速生长可因距离最近的血管太远而产生缺氧。这种缺氧环境可导致部分瘤细胞死亡；然而，还有一部分瘤细胞可存活并继续增殖。缺氧环境更有利于肿瘤干细胞的存活。存活的GBM细胞激活众多的信号通路如缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)，最终使存活的细胞获得适应低氧环境的能力，再次激活瘤组织中血管再生以及瘤细胞的恶性进展。

一、胶质瘤干细胞与缺氧

越来越多的研究表明，在恶性血液病及实体肿瘤中(如皮肤癌，乳腺癌，结肠癌等)均存在肿瘤干细胞。其中，胶质瘤干细胞(glioma stem cells, GSCs)具有无限的自我更新及重启肿瘤生长的潜在能力[5]。极少量的GSCs种植到免疫缺陷小鼠的颅内即可导致肿瘤的形成。由于GSCs对GBM的重要性，现今对其性质进行了许多深入研究[6-7]。GSCs虽然具有异常的分化信号，但仍可表达可识别的细胞谱系特征：例如GSCs具有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、及内皮细胞的潜能。此外，GSC还系对放疗及化疗抵抗的重要工具。事实上，通过化学治疗后存活的瘤组织中富含GSCs[8]。

胶质细胞瘤组织中实际上包含了不同类型以及不同分化程度的细胞，因而，确切地标记出肿瘤内GSCs有一定困难。如何定义并标记GSCs仍是一个值得探究的研究领域。目前有很多分子可用于GSCs定位，如Olig2、Musashi1、Sox2、Nestin和Nanog；还有一些细胞表面标记分子，包括CD44、CD15、α6整合素和CD133等。事实上，由于胶质细胞瘤及GSCs的异质性，没有单一的分子可作为准确的GSCs标记物。大规模的全基因组分析指出：GBM 还可分为4个亚型，如前神经亚型(Proneural, PN)，神经亚型(Neural, NE)，经典亚型(Classical, CL)以及间质亚型(Mesenchymal, ME)[9]。这些不同的亚型不仅具有不同的基因组表达特点，也具有不同的临床特征及干细胞特性：PN亚型的GSCs主要表达CD133标记，在体外培养时主要呈现为悬浮生长的神经球样干细胞；而ME亚型的GSCs细胞则表达CD44标记，在体外细胞培养时表现为半贴壁生长。PN亚型的肿瘤患者平均生存期比ME亚型的长一些。在对治疗的反应方面二者也有差异，如：CD44+的肿瘤细胞对放疗抵抗性更强，而对TMZ较为敏感；CD133+的瘤细胞正好相反，其对放疗较为敏感，对放疗则不敏感。另外，TMZ治疗胶质瘤的机制主要是通过甲基化O6位的鸟嘌呤而破坏DNA，但是GSCs表达O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT)，该酶可移除烷基而阻止细胞死亡。胶质瘤细胞MGMT启动子甲基化导致的MGMT表达降低的患者预后较好。因此，MGMT启动子甲基化可视为对TMZ敏感的一个因素。然而，GSCs在致病过程中还发展了与MGMT启动子甲基化无关的其他耐药机制，使得GSCs化疗抵抗性的机制更为复杂化[10]。

缺氧对GSCs的生存以及增殖具有重要意义，它导致的多灶性坏死是GBM的标志性组织病理学特征之一。缺氧微环境对于GBM细胞进展、代谢、迁徙、浸润和治疗抵抗性均起着重要作用。肿瘤实质内坏死区周围被致密的细胞所环绕，形成伪栅栏样的微观结构，是GBM特有的病理学特点。伪栅栏样结构区域的瘤细胞高表达干细胞标记分子，富含GSCs样细胞，因而这些缺氧区域是促进肿瘤细胞存活以及增殖的重要因素。研究指出，低氧环境可促进非胶质瘤干细胞(non-GSCs)重编程为肿瘤干细胞，且对GSCs的自我更新具有重要作用。细胞对缺氧的反应主要由HIF家族转录因子介导，其中HIF2α的表达与缺氧水平呈正相关，且可上调CD133表达水平。HIF2α还可正向调节GSCs的自我更新能力及众多干细胞因子的表达，包括Oct4、Sox2和c-Myc等。另外，缺氧也诱导HIF1α表达。采用基因沉默技术抑制HIF1α后可降低CD133+细胞的数量、并同时抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。缺氧环境下HIF1α介导的GSCs干细胞状态的维持依赖于Notch信号通路的激活[11]。事实上，沉默HIF1α或抑制Notch信号通路后均可干扰缺氧条件下GSC干细胞状态的维持。此外，HIF1α可与Notch的胞内结构域相互作用促进其稳定性，从而激活Notch信号通路，其信号通路抑制剂可阻断缺氧诱导的GSCs的存活以及侵袭性。

二、胶质瘤干细胞与血管分化

在GSCs的众多特点中，一个值得注意的是GSCs具有分化为血管内皮细胞和周细胞的潜能[12]。正常人类血管是一种高度结构化的动态系统，可为细胞、组织递送营养物质并运输细胞产物。然而，与正常组织不同，胶质瘤组织中的血管结构在形态和功能上都极为异常，其通透性较高，细胞的结构化差，且其构成的血脑屏障功能不完整。这些特点使得胶质细胞瘤中血管的运氧功能障碍，从而导致肿瘤局部缺氧。正常组织中的血管形成主要通过血管发生和血管再生，血管发生一般是在发育过程中通过内细胞分裂增殖而形成，而血管再生一般指在已有血管基础上通过出芽方式形成新的血管。另外在胶质瘤中，还存在独特的异常血管发生情况，包括血管共生(vascular co-option, VCO)和血管拟化(vasculogenic mimicry, VM)[13]。

GSCs对胶质细胞瘤中血管发生具有多方面的作用：首先，CD133+的GSCs高表达VEGF，VEGF不仅可促进内皮细胞迁移、增殖并形成血管结构，还可促使局部内皮细胞活性，从而募集骨髓来源的内皮祖细胞形成血管。更重要的是， GSCs本身可作为血管腔壁成分参与血管形成,这种现象成为肿瘤细胞的VM。参与VM的细胞一般是具有高度浸润性的瘤细胞。其次，人们发现胶质瘤组织中的血管内皮细胞具有瘤细胞的特点，尤其是具有与肿瘤细胞一致的基因组突变，提示其与肿瘤细胞具有相同来源。更多的研究表明，CD133+的GSCs可分化为中间体的CD133+/CD144+细胞，并进一步分化为成熟CD144+内皮细胞，所分化的内皮细胞高表达内皮细胞特异性因子CD105、CD31、CD34和VEGFR-2[14]。这些结果表明：GSCs具有向内皮细胞转化的潜能，从而参与肿瘤中的血管发生。

在正常脑及肿瘤组织中，血管周细胞是血管结构的重要组成部分。最新的研究指出，GSCs还可分化为血管周细胞，从而促进肿瘤中的血管形态及功能的形成。事实上，GBM肿瘤组织中的绝大部分血管周细胞都来源于转化的肿瘤细胞[15]。通过基因技术特异性的消除血管周细胞后，可抑制肿瘤中的血管形成并抑制肿瘤生长。有研究指出，血管周细胞向内皮细胞的迁移主要通过SDF-1/CXCR4信号轴实现，而GSCs向血管周细胞的分化依赖于TGF-β信号通路[15]。另外，Notch信号通路和HMGA2也对GSCs向血管周细胞分化发挥重要作用[16]。

三、缺氧参与调节胶质细胞瘤血管发生

缺氧不仅调节GSCs的存活与增殖等肿瘤生物学性质，还与GBMR的血管发生密切相关[17-18]：①缺氧可使多种血管发生因子表达上调(如VEGF、FGF、ADM、ZNF395等)；②缺氧可促进GSCs干细胞状态维持及增殖，并促进GSCs分泌血管发生因子[19]；③缺氧可促进GSCs的血管拟态或向血管细胞(包括内皮细胞和周细胞)分化，直接参与GBM中的血管发生[14-15,20]。例如，缺氧可促进GSCs表达内皮细胞标记物CDH5/CD144，并促进其形成血管样管腔结构[20]。缺氧可调控大量基因表达，这些基因组成一个复杂的分子网络，此分子网络中的重要基因包括缺氧诱导因子(HIF1α和HIF2α)、缺氧激活的细胞毒素、糖酵解代谢途径、浸润及迁徙相关分子、非折叠蛋白反应等，其功能涉及血管发生、耐药性、干细胞维持、糖酵解代谢、细胞增殖、迁徙及浸润性等多方面生物学功能[21]。因而，以肿瘤缺氧反应作为治疗靶点成为具有潜力的研究方向。

四、抗血管治疗及其耐药性

由于在正常人体组织中血管发生并不活跃，因此针对血管发生的抗血管治疗成为具有相对肿瘤特异性的重要策略。目前抗血管治疗的方案主要包括给予或过表达血管发生抑制因子，如针对VEGFA及其受体的各种中和抗体、干扰内皮细胞功能和抑制促血管发生因子的产生等。

在众多的促进血管发生的机制中，VEGF是目前研究最清楚的促进血管发生相关的信号通路。关于VEGF家族生长因子的成员、结构、功能以及表达的调节已经做了深入研究。胶质瘤中的许多成分都可以产生VEGF，如肿瘤细胞、肿瘤基质、炎症细胞及内皮细胞等。VEGF可刺激瘤组织中内皮细胞表达VEGF受体(VEGFR)，从而促进内皮细胞增殖、迁移和存活，并形成管腔结构。它还具有血管扩张作用，可增加血管通透性而加重肿瘤组织中的间隙压力。VEGF亦可促进内皮细胞分泌一氧化氮(nitric oxide, NO)合酶(nitric oxide synthase, NOS)，导致NO含量增加，而NO具有血管扩张作用。VEGF的这些作用是GBM肿瘤中形成异常血管及不完善的血脑屏障的重要因素，也因此而成为重要的抗血管治疗靶点。其中BEV是人工重组的VEGF单克隆抗体，可以阻止VEGF与受体的相互作用。BEV最初被批准用于治疗转移性结肠癌，随后用于治疗非小细胞肺癌、转移性肾细胞癌、子宫颈癌、对铂耐药的卵巢癌等多种肿瘤的化疗。

虽然BEV在许多肿瘤的治疗中都取得了一定效果，但其对胶质细胞瘤的治疗还存在一些问题。BEV可使胶质细胞瘤患者病情得到缓解，但对于延长患者生存期并无显著效果。与其他一些抗肿瘤药物类似，BEV会很快导致瘤细胞产生耐药性，认为BEV使瘤细胞耐药的一个重要机制是其可致GBM细胞的上皮细胞-间质转型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。另外BEV的使用可激活不依赖于VEGF的其他血管发生途径，如，BEV治疗可致其他促进血管再生相关因子的表达，包括bombina variegate peptide 8(BV8)、FGF1/2、IL-8等[22]。其次，缺氧环境可促进GSCs向内皮细胞或血管周细胞的分化，从而促进肿瘤细胞的血管拟态。由于BEV治疗耐药发生时肿瘤组织内再次产生缺氧环境，而在缺氧环境下，GSCs可高表达血管内皮细胞标记分子CD144，并促进GSCs的血管拟态能力[20]。显然，BEV在治疗早期可以逆转肿瘤组织内异常的血管使之正常化，改善瘤组织内的氧气状况，缓解缺氧环境所致的瘤细胞侵袭性。肿瘤的EMT则与缺氧环境密切相关。如缺氧可致MET表达升高，并通过MET/VEGFR2信号通路致EMT增强胶质细胞瘤的侵袭性[23]。尽管如此，对于BEV耐药机制的产生尚不完全清楚，由于抗血管的潜在治疗前景，对耐药机制的深入研究具有重要意义[22]。

五、展望

抗血管治疗在多种肿瘤的治疗中取得了一定的治疗效果，其对胶质细胞瘤的治疗具有潜在的应用前景。抗血管治疗的机制是通过抑制肿瘤中的血管发生，使瘤组织发生缺血、缺氧性坏死而抑制瘤细胞生长。作为GBM中的重要微环境因素，缺氧可通过调控大量分子的表达，影响肿瘤的血管发生[20]、浸润性进展等生物学特性。目前抗血管治疗以及联合其他治疗策略的临床研究已经开展，有一部分在临床前期研究中取得了一定效果。作为胶质细胞瘤耐药性及浸润性进展的重要因素[24]，缺氧可调控大量分子表达，这些分子相互作用形成一个复杂的分子网络。针对缺氧调控网络研究相应治疗靶点，有助于理解抗血管治疗耐药产生的机制，并最终为避免耐药产生、提高胶质细胞瘤抗血管治疗效果提供理论与临床应用基础。