发菜中糖基转移酶基因的克隆及原核表达

陈雪峰， 蔡国强， 范 华， 刘 欢

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

发菜，学名发状念珠藻，是一种经济价值极高的光能自养型陆生蓝细菌.在我国，野生发菜主要分布在干旱、半干旱的荒漠及半荒漠地带[1-3].发菜胞外多糖是发菜生长过程中分泌在细胞外的活性多糖，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、提高免疫力等生物活性，可以保护细胞，抵抗外界恶劣环境，赋予发菜较高的食用和药用价值[4-6].然而，发菜因为生长缓慢和过度采掘致使野生发菜资源濒临灭绝.如何通过人工培养的方式提高发菜及其胞外多糖的产量成为亟待解决的问题[7，8].

王贵春[9]发现在0.3 M盐浓度下，发菜胞外多糖产量较正常培养条件下提高了50.3%.赵秀霞[10]对0 M和0.3 M盐浓度下的发菜细胞进行转录组测序，得到13 170条差异表达基因，其中3 115条上调表达基因，10 055条下调，差异表达基因的GO功能聚类和Pathway代谢通路分析表明，涉及到光合作用、糖酵解/糖合成、Na+/K+运输、能量代谢、核糖体代谢、次级代谢产物生物合成等众多通路的基因都出现一定程度的差异表达[11,12].糖基转移酶是多糖合成途径中的重要酶，作用是催化活性糖基从糖基供体转移到糖基受体，形成特异的糖苷键，进而参与多糖重复单元的组装，对于多糖合成具有重要的调控作用[13,14].前期转录组测序结果发现发菜糖基转移酶基因在0.3 M盐浓度下转录水平较0 M提高了2.29倍.

本文对发菜中的糖基转移酶基因进行了克隆及生物信息学分析，并构建其重组表达质粒在大肠杆菌中成功高效表达.为发菜多糖合成调控机理的研究奠定了一定的理论基础,为糖基转移酶基因工程菌株的构建提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

本实验所用发菜、质粒pET-28a由陕西科技大学微生物制造研究室保藏;大肠杆菌BL21、DH5α感受态细胞以及各种试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司;pMD19T载体和各种限制性内切酶购于TaKaRa宝生物工程有限公司;溴酚蓝购于沈阳试三生化科技开发有限公司;考马斯亮蓝、SDS和甘氨酸购自美国Sigma公司;巯基乙醇来自国药集团化学试剂有限公司;30% 丙烯酰胺和TEMED来自碧云天生物技术公司.

1.2 仪器与设备

DYCZ-24EN蛋白电泳仪，江苏兴化市分析仪器厂;LDZX-30KBS高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂;MGC-400HP光照培养箱，上海善志仪器设备有限公司;HH-4恒温水浴锅，金坛市宏华仪器厂;Mastercycler nexusPCR仪，德国Eppendorf公司;DYY-2C琼脂糖凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂;FR-980A生物电泳图像分析系统，上海复日科技有限公司.

1.3 方法

1.3.1 目的片段TA克隆

按照天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组提取试剂盒方法提取发菜基因组DNA,根据转录组测序结果及NCBI相似基因序列同源比对分析后进行引物设计，上游引物的序列为G1：5′-ATGCAAATTCTGATTTAT-3′，下游引物的序列为G2：5′-TCAAATATCAACAAGTG-3′，由上海捷瑞生物工程有限公司合成.PCR反应体系为：发菜基因组DNA 2μL，上下游引物各1μL，2×Taq PCR MasterMix 10μL，ddH2O 6μL.扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃延伸5 min.1%琼脂糖电泳检测并回收产物，与pMD19-T载体连接，转化DH5α感受态，筛选阳性克隆进行菌液PCR检测后送至北京奥科鼎盛生物科技公司测序.

1.3.2 序列分析

将测序结果提交BLAST进行目的基因确认.使用DNAMAN软件对基因序列推译得到氨基酸序列，并和其他物种进行同源性比对分析.运用DNAstar对氨基酸序列进行基础性分析.利用ExPASy的ProtScale程序对目的蛋白进行亲水性和疏水性分析.利用DNAMAN和SOPMA软件对糖基转移酶的二级结构进行预测分析.利用TMHMM程序对目的蛋白进行跨膜区分析.利用NetPhos3.1 Server对目的蛋白进行磷酸化位点分析.

1.3.3 糖基转移酶的原核表达

根据测序结果，设计糖基转移酶基因的扩增引物，并在上下游的5′端添加BamHI和XhoI的酶切位点以及相应的保护碱基(A1:5′-CGCGGATCCATGCAAATTCTGATTTAT-3′;A2:5′-CCGCTCGAGAATATCAACAAGTG-3′).PCR

扩增条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环，72 ℃延伸5 min.反应后用1%琼脂糖凝胶电泳检测.

以糖基转移酶基因与pMD19-T连接而成的重组质粒为模板进行PCR扩增.将纯化后的PCR产物和pET28a质粒用BamHI和XhoI分别进行双酶切后相连，得到蛋白基因表达载体.将重组质粒转化到DH5α培养，通过卡纳青霉素筛选阳性克隆，提取质粒进行菌液PCR和双酶切验证.以阳性质粒转化BL21感受态细胞，并以终浓度1 mM的IPTG诱导目的基因表达，SDS-PAGE电泳进行分析.

2 结果与讨论

2.1 发菜以糖基转移酶基因TA克隆

提取发菜DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果符合预期大小(如图1所示).以发菜基因组DNA为模板，以G1和G2为引物进行PCR扩增，经1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，得到一条1 300 bp大小的特异性条带，与预期大小相符(如图2所示).将纯化回收后的发菜以糖基转移酶基因连接到pMD19-T 载体上，转化DH5α大肠杆菌，挑选阳性单克隆菌落，利用T载体通用引物对所选克隆进行菌落PCR鉴定，结果显示，成功筛得含有大小为1 500 bp(含克隆位点140 bp左右)的重组克隆载体的阳性菌株(如图3所示)，表明发菜以糖基转移酶基因成功克隆至pMD19-T 载体上.

M：λ DNA HindIII;1-2:发菜DNA图1 发菜基因组DNA抽提电泳图

M：DL2000；1：糖基转移酶基因图2 糖基转移酶基因的PCR扩增

M：DL2000；1-3：糖基转移酶基因阳性转化子图3 阳性转化子(DH5α)的PCR验证

2.2 发菜糖基转移酶基因序列分析

糖基转移酶基因与pMD19-T连接成功后，使用通用引物M13-47和RV-M对目的基因片段进行双向测序.结果表明：发菜糖基转移酶基因大小为1 290 bp.由糖基转移酶基因序列所推译的氨基酸序列表明糖基转移酶包含429个氨基酸残基.通过DNAstar 8.0分析表明糖基转移酶的带电荷总氨基酸为112个，占总氨基酸残基26.11%，其中带正电荷61个，带负电荷51个.极性氨基酸共有95个，占22.14% ，疏水氨基酸有184个，占42.89%，酸性氨基酸和碱性氨基酸分别占8.86%和10.72%.在糖基转移酶中含量最丰富的氨基酸为Leu(13.75%)、Ala(10.02%)、 IIe(7.93%)、Val(7.93%)、Gly(6.29%)，含量最少的氨基酸为Trp(0.70%)(如图4所示).

图4 糖基转移酶DNA的核苷酸序列(上行)及推导的氨基酸序列(下行)

通过DNAMAN软件将发菜中糖基转移酶的核苷酸序列及氨基酸序列与GenBank的同源物种序列进行BLAST比对，发现糖基转移酶基因具有较高的保守性，与点状念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)的核苷酸同源性达89.5%,与筒孢藻(Cylindrospermum stagnale PCC 7417)的核苷酸同源性达87.1%，与念珠藻(Nostoc sp.NIES 3756)的核苷酸同源性达76.5%，与节球藻(Nodularia spumigena CCY 9414)的核苷酸同源性达76.4%，与念珠藻(Nostoc sp.PCC 7524)的核苷酸同源性达73.5%，与多变鱼腥藻(Anabaena variabilis ATCC 29413)的核苷酸同源性达71.3%，与水胶须藻(Rivularia sp.PCC 7116)的核苷酸同源性达70.2%，与侧生藻(Fischerella sp.NIES 3754)的核苷酸同源性达69.1%(如图5所示).与Nostoc sp.KVJ20、Nostoc punctiforme、Cylindrospermum sp.NIES-4074、Nostoc linckia NIES-25、Nostoc sp.NIES-3756、Scytonema hofmanni、Nodularia spumigena、Hassallia byssoidea VB512170、Mastigocladopsis repens、Cylinfrospermum stagnale、Tolypothrix campylinemoides、Nostoc calcicola、Chrysosporum ovalisporum的氨基酸同源性分别达92%、91%、84%、83%、79%、79%、79%、78%、77%、77%、77%、77%、76%(如图6所示).

图5 糖基转移酶DNA 的核苷酸序列

图6 糖基转移酶DNA 的氨基酸序列

2.3 糖基转移酶基因的疏水性、跨膜区、磷酸化位点分析及二级结构预测

利用ExPASy软件对发菜糖基转移酶的氨基酸序列进行疏水性分析，结果显示第50位酪氨酸(Tyr)亲水性最强，第120位脯氨酸(Pro)疏水性最强.整体来看，亲水性区间分布更广，相对于疏水性区间较多，因此确定糖基转移酶是亲水性蛋白.

利用TMHMM程序对糖基转移酶进行跨膜区分析，结果表明，糖基转移酶不含跨膜区.

利用NetPhos对糖基转移酶的磷酸化位点进行预测，结果表明，糖基转移酶有2个Tyr磷酸化位点、9个Thr磷酸化位点和18个Ser磷酸化位点.

运用DNAMAN软件和SOPMA软件对糖基转移酶二级结构进行预测分析，虽然不同软件的算法存在差异，但经综合分析认为，发菜糖基转移酶的二级结构主要构成方式为α螺旋和随机卷曲(如表1所示).

表1 发菜糖基转移酶二级结构预测结果

2.4 糖基转移酶在大肠杆菌中的表达

构建糖基转移酶的表达载体pET28a-glycosyl transferase,转化到大肠杆菌后通过卡纳青霉素抗性挑选阳性克隆进行PCR验证，得到1 600 bp大小的特异性条带(加上克隆位点300 bp左右)，符合预期大小(如图7所示).抽取质粒进行双酶切验证，结果在1290 bp处出现1条特异条带，与预期片段大小一致(如图8所示).测序结果表明插入的片段就是糖基转移酶基因.

M：DL2000；1-3：糖基转移酶基因重组质粒阳性转化子图7 阳性转化子(DH5α/pET28a-Glycosyl transferase)的PCR验证

1：DL2000；2：双酶切后糖基转移酶基因；3：重组质粒双酶切；4：双酶切后pET28a；5：10 kb DNA ladder图8 阳性转化子(DH5α/pET28a-Glycosyltransferase)的酶切验证

将转化成功的阳性菌接种到含有卡那霉素的LB培养基，37 ℃，200 rpm培养至OD值为0.8时，加入IPTG使其浓度为1 mM，16 ℃，120 rpm培养20 h后取样进行电泳.SDS-PAGE电泳检测结果表明有外源蛋白表达(如图9所示)，参照蛋白分子量标准，外源蛋白分子量约为47.54 kDa，与预测的糖基转移酶分子量相同.

M：蛋白分子量标准；1: IPTG诱导的空质粒转化子；2：未诱导的阳性质粒转化子；3： IPTG诱导10 h的阳性质粒转化子；4：IPTG诱导15h的阳性质粒转化子；5：IPTG诱导20 h的阳性质粒转化子图9 糖基转移酶基因在大肠杆菌BL21中的表达

由于发菜全基因组尚未公布，因此通过BLAST比对高同源性的基因序列设计特异性引物进行克隆成为研究发菜基因的主要手段[15，16].所以本文根据转录组测序结果及同源比对分析设计引物进行糖基转移酶基因的克隆，成功得到大小为1 290 bp的目的序列.经同源性比较发现发菜糖基转移酶基因具有较高保守性，与点状念珠藻(Nostoc punctiforme PCC 73102)的核苷酸序列同源度达89.5%，与Nostoc sp.KVJ20的氨基酸序列同源度达97.3%.生物信息学分析表明糖基转移酶是亲水性膜外蛋白，有2个酪氨酸磷酸化位点、9个苏氨酸磷酸化位点以及18个丝氨酸磷酸化位点，二级结构主要构成方式为随机卷曲和α螺旋，等电点为9.33，正负电荷氨基酸残基数分别为61和51.这为进一步研究糖基转移酶基因在发菜多糖代谢中的分子调控机制奠定基础.此外，本实验构建了糖基转移酶基因的高效表达载体，且表达蛋白以可溶性蛋白形式存在，这为今后糖基转移酶基因工程菌株的构建提供理论依据.

3 结论

盐胁迫下发菜多糖产量提高，糖基转移酶基因转录水平上调.这暗示基因可能是盐胁迫下发菜胞外多糖代谢的关键调控因子，它们在发菜响应盐胁迫过程中发挥了重要的调节作用.糖基转移酶可以催化活性糖基转移，进而形成多糖合成所必须的活性糖核苷酸前体物质，参与多糖合成.说明发菜可能通过相关基因调控多糖合成途径以响应盐胁迫，这也从分子层面为"盐胁迫下发菜多糖产量明显提高"这一结论提供依据.然而，多糖代谢调控是一个复杂的生物调控过程，参与基因众多，它们如何在转录水平调控多糖代谢以响应盐胁迫还需要进一步研究.

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