伊犁地区蝴蝶兰软腐病病原体的分离与鉴定

张相锋等

摘要：以蝴蝶兰栽培品种软腐病感病植株叶片为材料，分离到6个单菌株。菌体在显微镜下呈短杆状，表现为兼性厌氧，革兰氏阴性，经回接致病性检测，均产生与田间相同症状，证明为蝴蝶兰软腐病病原体。同时还对所分离菌株进行了形态观察、染色反应、形态培养、生理生化特性鉴定等研究，根据伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）初步鉴定为欧文氏菌菊欧文氏软腐致病型菌（Erwinia chrysanthemi Burkolder，Mc Fadden&Dimock）。

关键词：蝴蝶兰；软腐病；分离鉴定；欧文氏菌菊欧文氏软腐致病型茵

蝴蝶兰（Phalaenopsis），是兰科（Orehidaeeae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）是著名的鲜切花种类。其花形如蝴蝶，萼片长椭圆形，唇瓣先端三裂，花色繁多，花期特别长，深受人们喜爱，被誉为“洋兰皇后”，是目前兰科植物中栽培最广泛，最普及的种类之一。

软腐病是目前蝴蝶兰栽培中最普遍且最致命的病害之一，在高温潮湿的条件下，发病旺盛。该病主要危害叶片，病斑可发生于叶片任何部位，一般情况下叶柄基部较多，在发病初期，病斑一般近圆形，多从叶边缘开始出现水渍状斑，有明显的轮纹界限，随着病势的迅速扩散，不再出现轮纹，2～3d后，受害叶片虽完整，但表皮开始分离，内部已经腐烂分解成浅白色半透明状液体，然后整个植株倒伏死亡，蔓延开来，会给蝴蝶兰生产带来巨大经济损失。由于蝴蝶兰适宜于在高温高湿环境下栽培，该条件更有利于软腐病病原体的生长和繁殖。蝴蝶兰软腐病病原菌菌株的分离与鉴定，有着重要的意义，逐渐得到广大国内外学者的关注，通过对蝴蝶兰软腐病病原菌菌株的致病性，病菌形态和培养性状观察，生理生化特性鉴定等研究的初步结果，旨为今后蝴蝶兰软腐病的防治、抗病种质筛选、抗病转基因以及抗病育种等的研究提供理论依据和实际指导，为蝴蝶兰这一世界名花的推广和开发提供条件。

1材料与方法

1.1材料

蝴蝶兰软腐病叶片；蝴蝶兰健康叶片；供试材料采自伊宁市平原林场。

1.2方法

1.2.1蝴蝶兰软腐病病原菌分离与纯化。在蝴蝶兰软腐病发病时，采集新鲜病叶，选取2片，用清水洗净。用75%的酒精做表面消毒后，用无菌水冲洗3次。在超净工作台条件下取病健交界部位叶片，用无菌刀片将叶片①切成1.5cm×1.5cm大小，在75%酒精中消毒后，用无菌水冲洗3次，然后接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上；将叶片②的病健交界部位用无菌刀片切下，在75%酒精中消毒后，捣碎，用接种环划线接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上。将培养基放在28℃恒温培养箱中培养24h。挑取典型菌落，用划线法分离，连续多次纯化，直至出现纯菌落，镜检下为纯的单一菌体，接种在斜面牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃恒温培养箱培养24h后，保存在4℃冰箱中备用。

1.2.2致病性观察。致病性测定、培养性状及菌体形态观察主要参照方中达和任欣正方法。本试验采用针刺法进行菌体的致病性检测。即选取健康的蝴蝶兰叶片用75%酒精表面灭菌后，用沾有菌苔的无菌针在蝴蝶兰叶片上进行针刺接种，对照组用无菌针沾无菌水扎孔。于28%恒温箱中培养，保持相对湿度60%～80%，接种后每天观察记录有无发病症状表现。

1.2.3病原菌菌体的培养特征及菌体形态观察。接种纯化的菌种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃培养48h后，按参照文献标准观察、记录菌苔的丰厚度、大小、边缘、表面形状、颜色、粘度、透明度。采用革兰氏染色法，在油镜下观察菌体形态。

1.2.4生理生化性状鉴定。生理生化的测定主要参考文献任欣正、周德庆的常规方法进行。材料为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上生长的备用病原细菌。生理生化的测定包括5%NaCl生长、37%下生长、淀粉水解、油脂水解、卵磷脂酶、明胶液化、糖发酵、苯丙氨酸脱氨酶、V.P.试验、柠檬酸盐还原、过氧化氢酶分解、产H₂S、产氨、吲哚试验、硝酸盐还原、甲基红，共16个项目。

2结果与分析

2.1病原菌的分离和纯化

在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28%培养24h。

病叶①：病原菌在病组织周围生长，形成多个圆形菌落，连成一片，如图1、图2。病叶②：病叶接种的菌落连成一片，如图3、图4。

分别对病叶①和病叶②的菌种进行多次分离纯化，直至出现单菌落。分别选出3株菌株进行标号，病叶①：R₁、R₂、R₃；病叶②：M₁、M₂、M₃。

2.2病原菌致病性测定结果

分离纯化的软腐细菌菌株接种于健康的蝴蝶兰叶片后，24h时在针刺孔周围出现腐烂状小点，颜色较正常组织稍深；然后腐烂的面积逐渐增大，向四周延伸；30h时每个针刺孔周围的腐烂面积都达到直径1～2cm；42h后蝴蝶兰叶片几乎全部腐烂，如图5。对照蝴蝶兰叶片正常。

2.3病原菌的鉴定

2.3.1菌体形态与染色反应。将分离纯化的菌株R₂、R₂、R₃、M₁、M₂、M₃，接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养24h，挑取纯化的单菌落（如图6），镜检，菌体均为短小杆状，散生排列（如图7）。革兰氏染色为阴性。

2.3.2病原菌的培养性状。将分离纯化的6株菌株接种到牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，记录其菌落形态（如表1）。由表1可以得出，待测菌株的培养性状与伯杰氏细菌鉴定手册上Erwinia chrysanthemi的培養性状基本一致，如图8、9，Erwinia chrysantbemi菌落培养性状为特征性凸起，菌落较小，菌落边缘呈波浪状或翻卷的“煎鸡蛋状”，而待测菌株则仅在菌落大小、边缘、颜色方面与Erwinia chrysanthemi有一些差异。endprint