灯盏花素对脑外伤大鼠皮质神经元自噬、炎症损伤及TLR4/NF-κB信号通路的影响*

童军卫 刘补兴 胡小铭 李 烨 刘正敏 蔡清风△

［1.浙江省台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院，浙江 台州 318050；2.浙江省台州医院，浙江台州 317000］

脑外伤（TBI）属于神经外科疾病，其致死致残率占全身创伤的首位［1］。TBI常见的治疗方法是开颅手术治疗，术后的会引发颅内感染，因此探寻降低颅内感染的药物成为研究的重点［2］。灯盏花素具有扩张脑血管、降低脑血管阻力、增加脑血流量、改善微循环、抗血小板聚集等作用［3］。近年来，不少学者将灯盏花素应用于TBI的治疗中，研究表明，灯盏花素可以提高重度脑损伤患者生活质量，减少并发症和后遗症的发生［4］。然而灯盏花素对TBI大鼠神经元自噬和炎症损伤的影响及其分子机制尚未见报道。本研究通过建立TBI大鼠模型，探究灯盏花素对神经元自噬和炎症损伤的影响及其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠70只，SPF级，8～10周龄，体质量（150±20）g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，许可证号：SYXK（京）2015-0037。

1.2 试药与仪器 灯盏花素（国药准字Z20053907，昆明龙津药业股份有限公司，批号20160604，规格20 mg/支）；米诺环素（批号0209833，日本昭和发酵工业株式会社）；RNA提取和反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶购自NEB公司；兔抗大鼠Beclin1多克隆抗、白细胞介素-6（IL-6）和TNF-αELISA试剂盒购自上海赛默科技生物发展有限公司；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 分组与造模 将造模成功的大鼠随机分成5组，每组10只，分别命名为为模型组、米诺环素组（45mg/kg）、灯盏花素低剂量组 （0.1 mg/kg）、灯盏花素中剂量组（0.5 mg/kg）、灯盏花素高剂量组（1 mg/kg），假手术组及模型组注射等量容积0.9%氯化钠注射液，持续治疗2周。脑外伤动物模型建立：依据文献［5］，将大鼠腹腔注射4%水合氯醛进行麻醉，剪毛消毒后将大鼠固定，于头皮正中切开，剥离右侧颅顶骨膜，用颅骨钻刺1个4mm的骨窗，剥开硬脑膜，在脑表面放置1枚垫片，从20 cm高度落下40 g的祛码撞击垫片，建立脑外伤模型；假手术组仅切开头皮、左顶部开骨窗，不致脑外伤，模型组和假手术组均用牙科水泥固定骨孔处，缝合头皮，然后将大鼠收回饲养。

1.4 标本采集与检测 大脑皮层组织分离：持续治疗2周后，将大鼠麻醉，消毒后用剪刀剪开头皮及颅骨，取出全脑，用10%甲醛溶液室温下固定24 h，然后去除脑膜及血管，从中分离大脑皮层组织，置于-80℃冰箱，备用。1）甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率：在冰冻切片机将大脑皮层组织切成8μm的薄片，室温干燥后，用PBS漂洗，干燥后用1%甲苯胺蓝染色20 min，水洗后放入0.5%盐酸乙醇溶液中分化，经梯度乙醇溶液脱水，二甲苯透明（25min），以中性树胶封片。计录存活神经元数量，计算皮质神经元存活率。2）qRT-PCR检测Beclin1 mRNA表达情况：提取大脑皮层组织总RNA，并将其反转成cDNA，引物序列：F：5′-TGGATCTGGACCAGG-3′。R：5′-CAAATAATTAAATC CTTCCACATCT-3′，以GAPDH为内参，进行qRTPCR。 反应体系：5×缓冲液 10μL，TaqDNA聚合酶1 μL，F 2 μL，R 2 μL，10 mM dNTPmix 1 μL，cDNA 1μL，ddH2O 33μL。 反应条件：95℃ 预变性 5 min，95℃变性30 s，59℃延伸15 s，40个循环，延伸时读取光密度（D）值，计算Beclin1 mRNA的相对表达量。3）免疫组化检测Beclin1蛋白的表达：制作大脑皮层石蜡切片（不超过5 mm），将组织切片在92～98℃条件下存放20 min，滴加正常山羊血清后，在组织玻片上分别滴加Beclin1一抗，于4℃过夜放置，复温后在组织玻片上滴加二抗，显色后，用苏木素复染，观察Beclin1在大脑皮层组织中的表达情况。4）ELSA检测血清中炎症因子IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达情况：采集各组大鼠眼眶静脉血，离心分离血清。采用IL-6和TNF-αELISA试剂盒检测血清中IL-6和TNF-α的表达情况。5）Western blot检测TLR4和核因子-κB（NF-κB）表达情况：取大脑皮层组织，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样体积20μL，电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，分别滴加兔抗鼠TLR4和NF-κB多克隆抗体，置于4℃下过夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。采用Gel-Pro analyzer4软件对SDSPAGE电泳图目的条带进行扫描，分析TLR4和NF-κB表达水平。

1.5 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率比较见表1。模型组皮质神经元存活率显著低于假手术组（P＜0.05）；米诺环素组和灯盏花素组皮质神经元存活率显著高于模型组（P＜0.05）；随灯盏花素剂量增加，皮质神经元存活率提高，呈剂量依赖性。

表1 各组甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率比较（±s）

表1 各组甲苯胺蓝染色检测皮质神经元存活率比较（±s）

与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与米诺环素组比较，#P＜0.05；与灯盏花素低剂量组比较，$P＜0.05；与灯盏花素中剂量组比较，&P＜0.05。

组 别 n假手术组 10模型组 10米诺环素组 10皮质神经元存活率（%）85.62±6.56 24.36±4.32*42.12±4.78△灯盏花素低剂量组 10 45.38±4.23△灯盏花素中剂量组 10 62.72±5.17△#$灯盏花素高剂量组 10 78.36±5.36△#$&

2.2 各组qRT-PCR检测Beclin1 mRNA表达情况比较 见表2。模型组Beclin1mRNA表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；米诺环素组和灯盏花素组Beclin1 mRNA表达水平显著低于模型组（P＜0.05）；随灯盏花素剂量增加，Beclin1mRNA表达水平降低，呈剂量依赖性。

表2 各组qRT-PCR检测大脑皮层Beclin1mRNA表达情况比较（±s）

表2 各组qRT-PCR检测大脑皮层Beclin1mRNA表达情况比较（±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10米诺环素组 10 Beclin1mRNA/GAPDH 0.21±0.02 0.96±0.12*0.78±0.08△灯盏花素低剂量组 10 0.74±0.07△灯盏花素中剂量组 10 0.56±0.05△#$灯盏花素高剂量组 10 0.38±0.04△#$&

2.3 各组免疫组化检测Beclin1蛋白表达情况比较见图1。模型组Beclin1的表达水平高于假手术组；米诺环素组和灯盏花素组Beclin1的表达水平低于模型组；随灯盏花素剂量的增加，Beclin1的表达水平降低，呈剂量依赖性。

图1 免疫组化检测大脑皮层Beclin1蛋白的表达水平（200倍）

2.4 各组ELSA检测血清中炎症因子IL-6、TNF-α表达情况比较 见表3。模型组IL-6、TNF-α表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；米诺环素组和灯盏花素组IL-6和TNF-α表达水平显著低于模型组 （P＜0.05）；随灯盏花素剂量的增加，IL-6和TNF-α表达水平显著降低，呈剂量依赖性。

2.5 各组 Western blot检测大脑皮层 TLR4、NF-κB表达情况比较 见表4。模型组TLR4和NF-κB表达水平显著高于假手术组（P＜0.05）；米诺环素组和灯盏花素组TLR4、NF-κB表达水平显著低于模型组 （P＜0.05）； 随灯盏花素剂量增加，TLR4、NF-κB表达水平降低，呈剂量依赖性。

表3 各组ELSA检测血清中炎症因子IL-6和TNF-α表达情况比较（μg/L，±s）

表3 各组ELSA检测血清中炎症因子IL-6和TNF-α表达情况比较（μg/L，±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10米诺环素组 10灯盏花素低剂量组 10灯盏花素中剂量组 10灯盏花素高剂量组 10 IL-6 TNF-α 0.67±0.14 0.56±0.11 3.18±0.24* 2.98±0.24*2.78±0.17△ 2.72±0.19△2.76±0.17△ 2.71±0.17△1.75±0.14△#$ 1.58±0.14△#$0.97±0.12△#$& 0.83±0.13△#$&

表4 各组Western blot检测TLR4和NF-κB表达情况比较（±s）

表4 各组Western blot检测TLR4和NF-κB表达情况比较（±s）

组 别 n假手术组 10模型组 10米诺环素组 10灯盏花素低剂量组 10灯盏花素中剂量组 10灯盏花素高剂量组 10 IL-6/GAPDH TNF-α/GAPDH 0.62±0.06 0.53±0.04 2.56±0.23* 2.44±0.20*2.16±0.17△ 2.03±0.15△2.14±0.15△ 2.00±0.12△1.62±0.10△#$ 1.48±0.08△#$0.86±0.06△#$& 0.73±0.04△#$&

3 讨 论

脑外伤是指脑部因暴力所伤，导致血络受损［6］。基于此理论，本研究采用祛码撞击的方法建立脑外伤大鼠模型，并以此为研究对象探究灯盏花素对脑外伤大鼠神经元自的噬影响。研究表明，灯盏花素注射液能够降低脑外伤患者血液黏度，疏通微循环［7］。然而灯盏花素对脑外伤大鼠神经元自的噬影响尚未见报道。Beclin1是判断自噬活性的重要指标。Ng G研究表明，Beclin1和Bcl-2共同参与组成Ⅲ型PI3复合物调控自噬［8］。张志雄研究表明，下调 Beclin1基因的表达可以抑制大鼠海马神经元自噬［9］。本研究表明，灯盏花素能够提高脑外伤大鼠皮质神经元的存活率，且随灯盏花素剂量增加，皮质神经元的存活效率增加；同时，灯盏花素能够降低大脑皮层中Beclin1表达水平，且随灯盏花素剂量增加，Beclin1的表达水平显著降低。

脑外伤出血部位和周围的炎症反应是引发脑损伤的重要环节［10］，其中参与炎症反应的炎症因子有IL-6、TNF-α，因此TNF-α和IL-6是评估脑外伤患者炎症反应的重要指标［11-12］。有研究表明，脑外伤大鼠大脑组织中TNF-α和IL-6表达水平显著升高，下调TNF-α和IL-6表达可以减少大鼠组织细胞的损伤，进而发挥对脑组织的保护作用［13］。本研究表明，模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α表达水平显著高于假手术组，提示脑外伤会引发严重的炎症反应综合征；灯盏花素组血清中IL-6和TNF-α表达水平显著低于模型组，且呈剂量依赖性，提示灯盏花素能减弱脑外伤大鼠的炎症反应。

TLRs能够介导炎症反应［14］。 研究表明，IL-6和TNF-α是由TLR4/NF-κB信号通路调控的，当细胞内TLR4被激活时，能够与热休克蛋白60（HSP 60）结合，进而激活 NF-κB［15］。 汪春研究表明，蛛网膜下腔出血可引发TLR4和NF-κB上调表达，同时可介导炎症因子增加［16］。本研究表明，灯盏花素能够抑制TLR4/NF-κB信号通路中TLR4和NF-κB蛋白的表达水平，且随灯盏花素剂量增加，TLR4和NF-κB表达水平显著降低，且呈剂量依赖性。

综上所述，灯盏花素能够减弱脑外伤大鼠皮质神经元自噬和炎症损伤，推测这一作用是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路来实现的，为脑外伤靶向药物的开发提供一定的理论基础。

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