三种血清学布鲁氏菌检测方法在不同疫苗免疫奶牛中的比较

张亮+王基隆+丁家波+解晓莉+刘来兴+谷祖烨+杨美+杨宏军

摘要：布鲁氏菌病是一种世界范围内广泛分布的严重人畜共患病。疫苗免疫和血清学诊断是有效控制和净化该病的两种重要措施，但疫苗免疫对血清学诊断存在较大影响。因此，弄清楚不同疫苗免疫在不同检测方法下的抗体消减规律显得尤为重要。本研究选取15头6月龄健康母牛，随机分为5个试验组，每组3头，分别为600亿单位A19疫苗注射组、600亿单位A19疫苗口服組、500亿单位S2疫苗口服组、500亿单位S2疫苗注射组和对照组。对不同组试验牛进行隔离饲养，免疫完成后进行一次带牛环境消毒。免疫完成后每月采集牛血制备血清保存，连续采集6个月，分别使用RBPT（虎红平板凝集实验）、iELISA、cELISA进行检测。结果表明，相比口服免疫方式，注射免疫方式的疫苗抗体峰值水平更高，抗体持续时间更长；注射免疫方式下，S2疫苗的抗体峰值水平高于A19苗，但抗体持续时间较短；口服免疫A19疫苗，6个月内三种方法均未检测到抗体。可见，疫苗免疫对布鲁氏菌病血清学诊断有明显的干扰作用，但对cELISA检测的影响时间较短，采用cELISA可有效区分疫苗免疫和野毒感染。针对不同免疫方式的不同疫苗，应选择合适的时间节点。

关键词：布鲁氏菌病； 疫苗； 抗体消长规律；检测方法

中图分类号：S852.5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0126-04

Abstract Brucellosis is a serious zoonosis that occurs in worldwide. Vaccine and sero-detection are two effective and common methods for its control in dairy herds. However， its sero-diagnosis is interfered by vaccine immunization， so it is important to know the dynamic changes of antibodies after being immunized with different vaccines based on various detection methods. Fifteen six-month-old healthy cows were randomly divided into five groups on average. Four treatment groups were inoculated by injection and oral immunization of 6×1010 unit A19 vaccine and 5×1010 unit S2 vaccine， respectively. Every group was separately kept after vaccination and environmental disinfection. The serum samples were monthly collected in six months and detected by RBPT， iELISA and cELISA. The results showed that the injected groups had a higher antibody peak level and longer antibody duration time compared with oral groups， and the S2 groups had a higher antibody peak level and shorter antibody duration time than A19 groups. No antibody was detected for A19 oral group by three methods in six months. All the results showed that vaccine immunization had obvious interference effect on sero-diagnosis. But the influencing time on cELISA was short， thus the vaccine immunization and wild strain infection could be effectively distinguished by cELISA. For different vaccines with different modes of immunization， the appropriate time node should be selected.

Keywords Brucellosis； Vaccines； Dynamical changes of antibody； Detection method

布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（Brucella）引起的一种以流产和发热为特征的人兽共患传染病，对人类健康和公共卫生构成了巨大威胁。布鲁氏菌病患者会出现骶髂关节炎及其它骨关节受损伤的痕迹，同时对生殖能力具有严重损害，家畜中，牛、羊、猪最常发生。布鲁氏菌可以寄生在乳腺和淋巴结内，病原体被不断地分泌到乳中，感染布鲁氏菌病的动物最常出现的临床症状是流产、死胎、早产或者弱胎，产奶量下降。动物感染布鲁氏菌病主要是通过接触感染、垂直传播、配种或呼吸道感染。布鲁氏菌具有胞内寄生的特性，因此被感染的人或动物一般需要接受长时间的抗生素治疗，而往往会留下严重的后遗症。目前，布鲁氏菌病并无治疗特效药，牧场对其清除多采用阳性检出淘汰配合疫苗免疫防护为主。疫苗预防接种是控制该病的良好手段，目前美洲国家使用的是用粗糙型布鲁氏菌RB51 制备的弱毒疫苗，该疫苗免疫动物后可以与自然感染的强毒相区分。目前，国内用于奶牛布鲁氏菌病防控的疫苗主要为S2株和A19株弱毒疫苗，两种疫苗适用的宿主广泛，毒力弱，免疫效果优良，前者免疫方法多以口服为主，后者采用注射免疫。临床上，疫苗免疫和血清学诊断是有效控制和净化该病的两种重要措施，但疫苗免疫对血清学诊断存在较大影响。另外，不同疫苗通过不同途径免疫，其抗体水平和保护率存在显著差异。因此，弄清楚不同疫苗免疫在不同检测方法下的抗体消减规律，将有助于科学选择合适的疫苗、正确的免疫方式和合理的检测方法，对我国布鲁氏菌病的防控与净化具有至关重要的作用。endprint

1 材料与方法

1.1 试验材料

6月龄育成母牛15头；虎红平板凝集抗原，购自中国兽医监察所；布鲁氏菌竞争酶联免疫吸附实验（cELISA）抗体检测试剂盒，牛布鲁氏菌间接酶联免疫吸附实验（iELISA）抗体检测试剂盒，购自瑞典SVANOVIR公司；牛布鲁氏菌S2疫苗，购自金宇保灵生物药品有限公司（20头份/瓶）；牛布鲁氏菌A19疫苗，购自中牧实业股份有限公司（20头份/瓶）。

1.2 试验方法

将15头试验奶牛平均分为5组，每组3头，分别为A19注射600亿单位组、A19口服600亿单位组、S2口服500亿单位组、S2注射500亿单位组和对照组，免疫剂量参照疫苗使用说明书。对不同组试验牛进行隔离饲养，注射前采血检测全部为布病阴性，免疫完成后进行一次带牛环境消毒。免疫完成后每月采集牛血制备血清保存，连续采集6个月，分别使用RBPT（虎红平板凝集实验）、iELISA、cELISA进行检测。

1.2.1 RBPT 将采集的血清用生理盐水进行梯度稀释，稀释倍数分别为20、21、22、23、24、25、26、27，分别取每个浓度的血清50 μL滴在干净的玻璃板上，滴加等量虎红平板凝集抗体晃动玻璃板，使抗原和血清充分混匀，4 min内观察结果。结果判定：凡是出现凝集者记为阳性，记录出现凝集的最大稀释倍数，阴性记作-1。

1.2.2 间接ELISA检测方法 按照iELISA检测试剂盒说明书进行检测，计算阳性百分率（PP），大于40记为阳性。

PP=检测样本或阴性对照OD值/阳性对照OD值×100

1.2.3 竞争ELISA检测方法 按照cELISA试剂盒说明书进行检测，计算PI值，大于20的记为阳性。

PI=100-Mean ODsamples/ctrl×100/ Mean ODconjugate control Cc

2 结果与分析

2.1 虎红平板凝集试验结果

虎红平板凝集结果（图1）显示，除A19疫苗口服组外，其它试验组在免疫1个月后，虎红抗体达到峰值，抗体水平随时间推移而降低。布鲁氏菌A19疫苗通过口服方式免疫牛只后，并不引起机体产生凝集抗体，这表明A19疫苗不能通过口服方式进行免疫。 A19疫苗与S2疫苗注射6个月后检测仍为阳性，S2疫苗口服3个月虎红检测转阴，这表明S2疫苗口服免疫对临床常规血清学检测的干擾较小。

2.2 间接ELISA检测结果

间接ELISA检测结果（图2）显示，除A19口服组外，其他试验组在免疫后2个月，抗体水平达到最大值，随后抗体水平随时间推移而降低，其中S2口服组在免疫后第6个月，判定值接近临界值。

2.3 竞争ELISA检测结果

竞争ELISA检测结果（图3）显示，A19注射组和S2注射组分别在免疫3个月后和免疫2个月后cELISA检测结果转阴，而S2口服组cELISA检测未出现阳性。

3 讨论与结论

本研究结果表明，免疫1个月后，A19疫苗注射组、S2疫苗注射组和S2疫苗口服组抗体水平都能达到峰值，之后抗体会随时间的推移逐渐回落。采用三种检测方法检测两种疫苗免疫1个月后的血清均显示阳性，这时采用血清学诊断无法区分疫苗免疫和野毒感染，但干扰持续时间存在明显差异。本试验条件下疫苗免疫对cELISA检测持续时间仅为3个月，而对虎红平板凝集试验和iELISA检测的干扰将持续至6个月以上。造成差异的主要原因是不同检测方法的诊断原理不同，虎红平板凝集试验检测布鲁氏菌凝集反应抗体水平，iELISA检测布鲁氏菌脂多糖（LPS）抗体水平，这两种检测方法所检测的抗体为布鲁氏菌的普遍性抗体，在疫苗株和野毒株之间无明显差异；cELISA检测则是基于粗糙型和光滑型两类布鲁氏菌的差异位点抗体（LPS的O链抗体），而大多数疫苗株为粗糙型，野毒株为光滑型，这预示着cELISA可用于育成牛疫苗免疫后的布鲁氏菌感染诊断。

从抗体水平情况来看，S2疫苗注射组虎红和iELISA检测抗体水平最高，A19疫苗注射组其次，S2疫苗口服组最低，这表明注射免疫方式能够更好地激发体液免疫。另外，A19疫苗口服组的试验数据显示，三种检测方法的结果都呈现阴性，说明口服A19疫苗不能有效引起免疫应答反应，即口服A19疫苗无免疫保护效果。从抗体消长情况来看，后续监测显示，A19疫苗注射组虎红和iELISA检测结果在11个月时全部转阴，S2疫苗注射组在7个月时全部转阴，这表明A19疫苗的抗体持续时间要远长于S2疫苗，佐证了A19疫苗保护期长于S2疫苗的事实。

总之，注射法比口服法在操作上比较方便（本试验口服法用去针头注射器直接注入口内），且不同牛间效果差异小，抗体水平较高，抗体维持时间长，为首选免疫方式。A19疫苗与S2疫苗在毒力和适用对象上有所区别，A19疫苗毒力较强，多用于3月以上的育成牛使用，不能用于孕牛；S2疫苗毒力较小，多用于成牛使用，口服对孕牛安全。S2疫苗在抗体水平上要高于A19疫苗，但在保护时间上次于A19疫苗，故在免疫时应根据牛群的差异有选择性地使用。依据本试验数据，建议有布鲁氏菌免疫需求的牧场，可采取犊牛3～6月龄A19疫苗首次免疫，9～12月龄A19疫苗加强免疫一次，成年牛采用S2口服免疫。

本试验受试验场地和牛只结构单一的影响，不能完全代表牛群疫苗免疫后的全部情况。然而，本研究从实验的角度上分析了两种疫苗不同免疫方式对布鲁氏菌血清学检测的影响，对牛场布病监测和疫苗免疫方案的制定具有指导意义，可使牧场更准确地掌握自身实际情况，制定针对性的合理防控方案。

参 考 文 献：

[1] 丁家波， 程君生， 牟巍， 等.布鲁氏菌S2 WboA基因缺失株的构建及免疫效果[J]. 中国农业科学， 2008， 41（8）： 2448-2453.endprint

[2] 张剑， 马卫明， 张亮， 等. 牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用[J].中国农业科学， 2013，46（14）：3460-3469.

[3] 毛开荣. 动物布鲁氏菌病防治技术研究进展[J].中国兽药杂志，2003（9）：37-40，81，83.

[4] 宋之先， 朱鹤赐， 胡振武，等.布鲁氏菌羊种 M5-90 弱毒菌苗对新疆孕绵羊的安全性试验[J].中国畜禽传染病，1988（6）： 17-18.

[5] Hamdy M E， Amin A S. Detection of Brucella species in the milk of infected cattle， sheep， goats and camels by PCR[J]. The Veterinary Journal，2002，163：900-908.

[6] 罗德炎.布氏杆菌病新型疫苗的研究进展[J].免疫学杂志，2004，20（3）：43-49.

[7] 陈乃昌， 施宏武， 赫崇礼，等. 布鲁氏菌 M5-90 菌苗对山西土种黄牛三年免疫期试验[J].中国畜禽传染病，1989（2）： 15-16.

[8] 卢道纯， 石宗舫， 宋之先，等. M5 菌苗对鹿的免疫试验的研究[J].家畜传染病，1984（2）： 17-20.

[9] Ko J， Splitter G A. Molecular host pathogen interaction in brucellosis： current understanding and future approaches to vaccine develo pment for mice and humans[J]. Clinical Microbiology Reviews， 2003， 16： 65-78.

[10]王加兰， 胡森， 高洪霞，等.光滑型布鲁氏杆菌抗体竞争 ELISA 检测方法的建立[J].中国兽医科学，2009，39（9）：803-810.

[11]Boschiroli M L， Fomlongne V， OCallaghan D. Brucellosis： a worldwide zoonosis[J]. Current Opinion in Microbiology，2001， 4（1）：58-64.

[12]Pappas G， Papadimitriou P， Akritidis N， et al. The new global map of human brucellosis[J]. Lancet Infectious Disease， 2006， 6（2）：91-99.

[13]Comerci D J， Pollevick G D， Vigliocco A M， et al. Vector development for the expression of foreign proteins in the vaccine strain Brucella abortus S19[J]. Infection and Immunity， 1998， 66（8）： 3862-3866.

[14]Bax H I， van Veelen M L， Gyssens I C，et al. Brucellosis， an uncommon and frequently delayed diagnosis[J]. The Netherkands Journal of Medicine， 2007， 65（9）： 352-355.

[15]陳瑞花，张辉，唐利燕，等. 布鲁氏菌外膜蛋白BP26细胞毒性作用的研究[J]. 中国农业科学，2012， 45（16）：3406-3413.

[16]殷文武，孙辉.中国布鲁氏菌病疫情形势及对策建议[J]. 疫病监测， 2009， 24（7）：475-477.

[17]杨艳玲. 羊布鲁氏菌蛋白质组学分析及免疫候选抗原的筛选与鉴定[D]. 长春：吉林大学， 2011.

[18]OCallaghan D， Cazevieille C， Allardet-Servent A，et al. A homologue of the Agrobacterium tumefaciens VirB and Bordetella pertussis Ptl type IV secretion systems is essential for intracellular survival of Brucella suis[J]. Molecular Microbiology， 1999， 33（6）：1210-1220.

[19]Boschiroli M L， Ouahrani-Bettache S， Foulongne V， et al. The Brucella suis VirB operon is induced intracellularly in macrophages[J]. The National Academy Sciences of the USA， 2002， 99（3）：1544-1549.

[20]Pizarro-Cerdá J， Moreno E， Gorvel J P. Invasion and intracellular trafficking of Brucella abortus in nonphagocytic cells[J]. Microbes and Infection， 2000， 2（7）： 829-835.

[21]Lestrate P， Delrue R M， Danese I， et al. Identification and characterization of in vivo attenuated mutants of Brucella melitensis[J]. Molecular Microbiology， 2000， 38（3）： 543-551.

[22]Naroeni A， Jouy N， Ouahrani-Bettache S， et al. Brucella suis-impaired specific recognition of phagosomes by lysosomes due to phagosomal membrane modifications[J].Infection and Immunity， 2001， 69（1）： 486-493.

[23]Patey G， Zhong Q， Bourg G， et al. Swapping of periplasmic domains between Brucella suis VirB8 and a pSB102 VirB8 homologue allows heterologous complementation[J]. Infection and Immunity， 2006，74（8）：4945-4949.

[24]Terradot L， Bayliss R， Oomen C， et al. Structures of two core subunits of the bacterial type IV secretion system， VirB8 from Brucella suis and ComB10 from Helicobacter pylori[J]. The National Academy Sciences of the USA， 2005，102（12）：4596-4601.endprint