聚肌胞对禽流感油乳剂疫苗的体液免疫增强作用研究

黄艳艳+李悦+张琳+马鑫鑫+许传田+张秀美+刘思当+吴家强

摘要：为了研究聚肌胞是否能够增强油乳剂灭活疫苗免疫后鸡群的体液免疫应答，将3个不同来源的聚肌胞产品与H5亚型禽流感病毒灭活抗原相混合，使用轻质矿物油乳化制备疫苗，分别免疫21日龄SPF鸡，同时设置添加抗菌肽的疫苗免疫组、常规油乳剂疫苗免疫组以及不免疫对照组。在免疫后第14、21、28、35 d分别翅下静脉采集SPF鸡抗凝血，通过血凝抑制试验检测鸡血清中禽流感抗体的水平，使用统计学方法评价疫苗中添加聚肌胞对鸡群体液免疫反应的影响。结果发现，添加了聚肌胞或抗菌肽的疫苗免疫后，鸡血清中禽流感抗体水平显著高于普通油苗组。另外，不同来源的聚肌胞产品（PIC-1、PIC-2和PIC-3）免疫增强作用存在差异，以PIC-1免疫增强效果最好。在PIC-1疫苗免疫后，鸡血清抗体增长快，且可维持较高水平。总之，本研究表明聚肌胞是良好的禽病毒性疫苗免疫增强剂；不同厂家的聚肌胞产品质量有差异，应择优使用。

关键词：聚肌胞；免疫增强剂；鸡；禽流感；疫苗

中图分类号：S852.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）12-0100-04

Abstract To evaluate the efficacy of poly I∶C （PIC） as adjuvant for avian influenza vaccines， three different sources of PIC were mixed with viral antigens of H5 avian influenza virus， and oil emulsion vaccines were developed. Twenty-one-day-old specific-pathogen-free （SPF） chickens were vaccinated with either vaccine. Meanwhile， an unvaccinated chicken group， a cecropin-added oil emulsion vaccine group and a common oil emulsion vaccine （vaccine control） group were set. Chicken blood was collected on the 14th， 21st， 28th and 35th day after vaccination to test serum antibody levels against avian influenza by hemagglutination inhibition assay. Statistic analysis showed that chickens vaccinated with PICs or cecropin adjuvant developed significantly higher antibody level compared to the vaccine control group. Further， PIC of different sources （PIC-1， PIC-2 and PIC-3） showed varied immune-enhancing effects and that of PIC-1 was the best. After vaccinated with PIC-1， the serum antibody of chickens increased fast and could maintain at higher level. In conclusion， PIC is a better promising adjuvant for chicken viral vaccine， and its efficacy may vary due to the sources.

Keywords Poly I∶C；Immunopotentiator； Chicken； Avian influenza； Vaccine

禽流感是危害我國养禽业的一类重要传染病，我国采取灭活疫苗免疫和扑杀相结合的措施应对高致病性禽流感在家禽中的传染[1]。疫苗的普遍采用极大程度上降低了禽流感易感家禽的比例，对禽流感的防控起到了积极作用。油乳剂灭活疫苗与活疫苗相比，免疫保护产生得慢，因此生产上迫切需要改进型的禽流感灭活疫苗，以缩短疫苗免疫后的保护空白期，提高疫苗对鸡群的保护效率。新型免疫增强剂如干扰素、白介素、细胞模式识别受体激动剂等可有效增强机体的细胞/体液免疫应答，缩短疫苗使用后的免疫保护空白期，因此成为近年来的研究热点[2，3]。

聚肌胞（poly I∶C， PIC）是人工合成的病毒双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）类似物，可替代病毒dsRNA用作Toll样受体3（TLR3）和维甲酸诱导基因I受体（RLR）的激动剂[4]，目前已有多个含PIC的抗病毒和抗肿瘤药物的报道[5]。本课题组以鸡源细胞和SPF鸡为模型所做的试验表明，PIC转染后可迅速激活细胞和鸡体的固有免疫应答，引起细胞模式识别受体（TLR3和MDA5）和细胞因子（IFN-β、IFN-γ和IL-6）基因转录水平的迅速上调（另文报道）。此外，有研究表明PIC对获得性免疫也有显著增强作用[6]。国内也有将PIC用作家禽抗病毒药物和疫苗佐剂的报道，但应用效果不一[7-11]。本研究中，笔者在禽流感油乳剂灭活疫苗中添加不同来源的聚肌胞，检测其对鸡体液免疫应答的影响，为禽流感灭活疫苗的改进提供依据。

1 材料与方法

1.1 免疫增强剂溶液的配制

丁胺卡那霉素耦合聚肌胞PIC-1、PIC-2和PIC-3分别购自国内3个生产厂家，使用pH 7.4 PBS配制2 mg/mL的溶液。作为对照的天蚕素抗菌肽（Cecropin）为中农颖泰产品，使用灭菌生理盐水配制2 mg/mL的溶液。置于-20℃保存备用。endprint

1.2 病毒、抗原、白油和疫苗配制

H5亚型禽流感油乳剂疫苗（普通油苗）和添加免疫增强剂的禽流感油乳剂疫苗，均在某疫苗公司定制，使用进口低粘度白油作为佐剂（法国道达尔公司产品）。血凝抑制试验（hemagglutinin-inhibitation test， HI）抗原亦由上述疫苗公司提供。添加免疫增强剂的禽流感油乳剂疫苗的制备工艺如下：将聚肌胞或抗菌肽分别与含4%Tween-20的病毒抗原混合作为疫苗水相，白油中加入Span-80作为油相，水相和油相以2∶5的比例混合，乳化制苗。疫苗中PIC的终浓度为170 μg/mL，抗菌肽的终浓度为15 μg/mL。

1.3 SPF鸡和采血器材

21日龄SPF白色来航鸡，购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡研究中心。一次性蝶形采血针和EDTA抗凝真空采血管，为北京美科美加生物科技有限公司产品。

1.4 SPF鸡免疫试验

试验分为6组（表 1），其中包括普通油苗免疫组1个、含免疫增强剂油苗免疫组4个以及健康对照组1个，每组各10只鸡。除健康对照外，其它组别的鸡只通过颈部皮下接种相应的疫苗（0.3 mL/只）。在免疫后第14、21、28、35 d，分别经翅下静脉采集每只鸡的血液并以EDTA抗凝，然后分离血清，冻存备用。

1.5 疫苗免疫后鸡血清抗体产生情况分析方法

HI试验检测鸡血清的禽流感病毒抗体效价，比较不同疫苗免疫后血清抗体产生速度和水平：（1）比较含免疫增强剂油苗和普通油苗免疫后的抗体情况，评价疫苗中添加免疫增强剂对鸡体液免疫的作用；（2）比较含不同免疫增强剂的疫苗免疫后的抗体情况，评价不同免疫增强剂对鸡体液免疫的作用。使用t检验（Students t-test，Microsoft Excel 2007）的单因子方差分析对各试验组抗体水平进行差异显著性分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著，P<0.001为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 试验期间鸡群状况和鸡血清抗体检测结果

试验期间，所有鸡只采食、饮水正常，疫苗免疫后鸡群未见有不良反应。健康对照组的鸡只在4次抗体检测中均未测到禽流感HI抗体，而各免疫组血清抗体水平随着时间推移逐渐增高（表1）。

2.2 禽流感抗体水平差异显著性检验结果

表2为单因子方差分析疫苗中添加免疫增强剂的作用结果，表明在免疫后第14 d，PIC-1和PIC-3组抗体水平显著或非常显著高于普通油苗对照组；在免疫后第21 d，添加了聚肌胞的各免疫组血清抗体水平显著或极显著高于普通油苗组；在免疫后第28 d，PIC-1疫苗组的血清抗体水平非常显著高于普通油苗组（P<0.01）；在免疫后第35 d，PIC-1和PIC-2免疫组的血清抗体水平显著或非常显著高于普通油苗组。

不同免疫增强剂组间，在4次检测中PIC-1免疫组HI抗体水平有1～2次显著高于其它免疫增强剂组；而PIC-2、PIC-3和天蚕抗菌肽组之间的血清抗体水平无显著差异（P>0.05）。

3 讨论与结论

本研究将含有聚肌胞或抗菌肽的H5亚型禽流感油乳剂灭活疫苗免疫SPF鸡，检测了免疫后5周内禽流感血清抗体的产生情况。研究发现，在疫苗水相中添加免疫增强剂能够显著增强疫苗免疫后鸡抗体应答水平，聚肌胞相比抗菌肽对鸡体液免疫的刺激作用更强。

聚肌胞已被证实具有良好的细胞免疫刺激作用[4，12]。由于抗体监测是临床上评价禽流感疫苗免疫效果的主要手段，本研究从体液免疫的角度着手，测定和分析了添加聚肌胞是否会增强禽流感油乳劑疫苗的体液免疫效果。为避免聚肌胞产品差异对试验结果的影响，研究选取了3个不同厂家的聚肌胞进行试验。结果表明，3个聚肌胞产品对禽流感油乳剂疫苗的免疫增强作用的确有差异：其中PIC-1疫苗组在全部4次采样检测时的抗体水平与普通油苗组均有显著差异，表明PIC-1的体液免疫增强效果优于其它2个PIC产品。

总之，本研究表明聚肌胞可促进禽流感油乳剂疫苗免疫后鸡体的体液免疫应答，疫苗生产实践中需甄别PIC产品质量，择优使用。

参 考 文 献：

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