转录激活因子3通过调控活化T细胞核因子1介导足细胞损伤

梁 顺 张 鸿 杜 玥 章良佑 何 敏 李中和 刘双信 杜 艺 章 斌

转录激活因子3通过调控活化T细胞核因子1介导足细胞损伤

梁 顺1张 鸿2杜 玥3章良佑3何 敏3李中和1刘双信3杜 艺1章 斌3

目的：探讨辅助转录因子——转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)调控活化T 细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)在足细胞损伤中的作用。 方法：(1)通过免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜，观察ATF3在不同肾小球疾病患者足细胞中的表达,并通过Western印迹验证不同肾小球疾病患者肾组织ATF3的表达情况；(2)体外培养小鼠永生化足细胞，用脂多糖(LPS)100 μg/ml和ionomycin 2 μmol/L分别刺激足细胞0h、1h、2h、4h、6h后，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹检测ATF3 mRNA和蛋白的表达；(3)足细胞转染ATF3 siRNA后，通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况，RT-PCR和Western印迹检测凋亡相关标记物BAX、Bcl-2的表达，Western印迹检测足细胞标记蛋白podocin的表达；(4)通过Western印迹、免疫荧光染色、激光共聚焦观察在LPS和Ionomycin刺激下细胞核内ATF3表达情况；(5)通过免疫染色质共沉淀(ChIP)实验观察ATF3与核转录因子NFATc1启动子之间的关系，并通过RT-PCR和Western印迹检测足细胞沉默ATF3后对NFATc1的mRNA及蛋白表达的影响。 结果：(1)与正常肾组织相比，肾小球疾病患者肾组织足细胞ATF3表达明显增多；(2)用LPS和Ionomycin刺激足细胞，2h后ATF3的表达增高最明显，随后降低，到6h基本恢复正常；(3)沉默ATF3基因后，细胞凋亡率减少，凋亡相关标记物BAX下调，Bcl-2上调，并部分逆转足细胞标记蛋白podocin的下调；(4)在损伤刺激后，细胞核内ATF3表达增多；(5)ChIP实验显示ATF3与核转录因子NFATc1的启动子区域有结合，在Ionomycin刺激后，结合量明显增加，且沉默ATF3基因后，NFATc1表达减少。 结论：辅助转录因子ATF3参与NFATc1介导的足细胞损伤，即通过结合NFATc1启动子，增强NFATc1表达，促进足细胞损伤。

足细胞 转录激活因子3 活化T细胞核因子1

足细胞损伤是蛋白尿发生的重要原因，但其损伤机制尚未完全清楚。本课题组[1-4]和国外[5-7]多个研究结果表明，核转录因子——活化T 细胞核因子(Nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1,NFATc1)是足细胞损伤、凋亡、肾小球硬化的重要因子。核转录因子NFATc1具有自身增强效应[8]，这种自身增强效应还需要有其他辅助转录因子的参与。转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)是应激诱导性辅助转录因子，是ATF/CREB转录因子家族的成员[9]，具有亮氨酸拉链结构(bZIP)，bZIP是DNA结合位点，可以通过其bZIP结合其他含bZIP蛋白调控转录[10]。ATF3在心肌细胞[11]、破骨细胞[12]、肿瘤细胞[13]等领域得到广泛研究，然而在足细胞中表达及效应尚无报道。本研究拟通过人类肾小球疾病及细胞模型观察ATF3在足细胞中的表达，在体外实验验证ATF3在损伤条件下的变化，并进一步探究辅助转录因子ATF3对足细胞效应机制是否与核转录因子NFATc1有关。

材料与方法

主要仪器和试剂胎牛血清、0.05%胰酶(Gibco)；RMPI 1640培养基(CORNING)；γ干扰素(ProSpec)；核浆蛋白提取试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(凯基)；ATF3、NFATc1抗体(Abcam)；GAPDH 抗体(Bioworld)；Histone、Bcl-2抗体(CST)；podocin抗体、钙离子霉素(ionomycin)、脂多糖(LPS)(Sigama)；BAX、Synaptopodin、WT1抗体(Santa)；荧光二抗488、荧光二抗555(Thermo)；逆转录试剂盒、SYBR GREEN(Takara)；lipofectamine 2000、Trizol(Life Technologies)；ATF3 siRNA(广州锐博)；ChIP试剂盒(Thermo)。

足细胞的培养和实验分组条件永生化小鼠足细胞系由美国J. Resier 教授(Rush University Medical Center,Chicago,IL,USA)惠赠。足细胞先在33℃、5% CO2培养箱中增殖，细胞融合达到70%～80%时转入5% CO2、37℃培养箱中分化，在37℃培养10～12d，足细胞分化成熟。本实验所有足细胞实验均在分化成熟后进行。

为明确LPS和Ionomycin诱导ATF3的时间效应，分组如下：(1)LPS(100 μg/ml)和Ionomycin(2 μmol/L)培养刺激0h、1h、2h、4h、6h。为探讨沉默ATF3对足细胞损伤的影响，分组如下：(2)Control组(正常对照组)、Control-siRNA组、ATF3 siRNA组，siRNA浓度均为50 nmol/L；(3)Ionomycin(2 μmol/L)干预：Ionomycin-24h组、Control-siRNA+Ionomycin组、ATF3-siRNA#2+Ionomycin组，作用时间均为24h。为探究LPS和Ionomycin刺激下ATF3细胞核内表达，分组如下：(4)LPS组(100 μg/ml)、Ionomycin组(2 μmol/L)，作用时间均为2h。

siRNA转染将50 nmol/L siRNA与8 μl lipofectamine 2000的混合液加入无血清无抗生素培养基内，6h后换成完全培养基继续培养24h。

免疫荧光将细胞或肾组织固定、透化、封闭，然后滴加一抗过夜，加入二抗，封片，通过激光共聚焦显微镜观察。其中肾小球疾病患者足细胞是在肾活检组织免疫荧光染色中通过足细胞标记蛋白WT1来标记足细胞。

Western印迹提取蛋白，加入变性液煮沸变性。蛋白经电泳、电转到PVDF膜上，封闭，加入一抗二抗孵育，用化学发光液曝光，Image J软件分析灰度值。

实时荧光定量PCR(RT-PCR) Trizol法提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。按照SYBR Green PCR试剂盒说明书操作检测目的基因表达。引物序列：ATF3 正义链5′-G￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣T￣G￣C￣T￣A￣A￣C￣C￣T￣G￣A￣C￣A￣C￣C-3′，反义链5′-T￣T￣G￣A￣C￣G￣G￣T￣A￣A￣C￣T￣G￣A￣C￣T￣C￣C￣A￣G￣C-3′；GAPDH正义链5′-A￣G￣G￣T￣C￣G￣G￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣C￣G￣G￣A￣T￣T￣T￣G-3′，反义链5′-T￣G￣T￣A￣G￣A￣C￣C￣A￣T￣G￣T￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣G￣G￣T￣C￣A-3′；NFAT 正义链5′-C￣T￣C￣G￣G￣C￣C￣T￣T￣T￣G￣C￣C￣C￣A￣T￣C￣T￣C-3′，反义链5′-A￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣C￣G￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣C￣T￣G￣A-3′。每个样本设3个复孔，定量结果取平均值。

流式细胞仪检测细胞凋亡收集各组细胞，用Binding Buffer重悬细胞，加入Annexin V-FITC避光孵育15 min，再加入PI，在1h内用流式细胞仪检测。

免疫染色质共沉淀(ChIP)实验甲醛处理并收集细胞，超声破碎，然后加入ATF3抗体，与ATF3蛋白-NFATc1 DNA复合物相互结合，加入Protein A结合ATF3抗体-ATF3蛋白-NFATc1 DNA复合物，并沉淀，清洗，得到富集的ATF3蛋白-NFATc1 DNA复合物，加热解交联，纯化富集的NFATc1 DNA片断通过PCR分析。

统计学处理采用统计软件SPSS 19.0进行统计学分析，符合正态分布计量资料用均数±标准表示，组间比较用单因素方差分析，采用LSD检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

ATF3在肾小球疾病患者肾组织的足细胞中表达增多免疫荧光染色后，通过肾小球足细胞标记蛋白WT1来定位足细胞，结果显示正常肾组织的足细胞中ATF3的表达量很少,而在微小病变肾病(MCD)、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、糖尿病肾病(DN)患者的肾小球足细胞内ATF3的表达量明显增多。同时，通过提取MCD、FSGS、DN患者肾组织及正常肾组织蛋白质后，Western印迹也显示与正常肾组织相比较，MCD、FSGS及DN患者肾组织中ATF3的表达明显增加(图1)。

图1 ATF3在不同类型肾小球疾病肾组织的足细胞中表达增多MCD：微小病变肾病；FSGS：局灶节段性肾小球硬化；DN：糖尿病肾病；ATF3：转录激活因子3；A:人类肾组织免疫荧光染色(绿色为ATF3，红色为WT1，激光共聚焦显微镜×400，箭头指示ATF3和WT1染色Merge后双染色的足细胞)；B:人类肾组织蛋白Western印迹及定量；Normal为肾癌患者周边正常肾组织，MCD、FSGS、DN为不同类型的肾小球疾病患者肾穿组织标本；1：Normal组；2：MCD组；3：FSGS组；4：DN组；与Normal组比较，*P<0.05,n=3

足细胞ATF3在损伤刺激(LPS和Ionomycin)后表达增加用LPS处理足细胞0h、1h、2h、4h、6h，结果显示ATF3 mRNA及蛋白在LPS刺激后开始升高，ATF3 mRNA在2h表达量达到高峰后，ATF3蛋白在4h表达量最大，随后均逐渐下降(1、2、4均P<0.05)，到6h基本恢复到正常时水平(P>0.05)。用Ionomycin干预足细胞0h、1h、2h、4h、6h后，结果显示ATF3 mRNA和蛋白在Ionomycin刺激后开始升高，到2h表达量达到高峰后逐渐下降(1h、2h、4h均P<0.05)，到6h基本恢复到正常时水平(P>0.05)(图2)。

图2 LPS和Ionomycin处理后，足细胞ATF3表达增加 LPS:脂多糖；ATF3：转录激活因子3；Ionomycin:钙离子霉素；A、C：LPS干预足细胞不同时间对ATF3表达的影响；B、D:Ionomycin干预足细胞不同时间对ATF3表达的影响(A、B为实时定量PCR，C、D为Western印迹及定量分析)，与0h相比，*P<0.05,n=3

沉默ATF3对足细胞的保护作用验证三组ATF3-siRNA的效率,结果显示ATF3-siRNA#2组沉默效率最高。ATF3-siRNA#2沉默ATF3后，通过Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡情况，结果显示ATF3-siRNA#2+Ionomycin组与Ionomycin-24h组相比凋亡率减少(P<0.05)。检测凋亡相关标记物BAX、Bcl-2发现，沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin组与Ionomycin-24h组相比BAX表达下调，Bcl-2表达上调。同样在沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin组Podocin蛋白表达量较Ionomycin-24h组增高(P<0.05)。以上结果提示沉默ATF3对足细胞具有保护作用，即对足细胞而言，ATF3是一个损伤因子(图3)。

损伤性刺激(LPS和Ionomycin)诱导足细胞核ATF3表达增加用LPS和Ionomycin刺激足细胞2h后，通过DAPI标记细胞核，足细胞骨架蛋白Synaptopodin定位足细胞，免疫荧光染色结果显示，与Control组相比，LPS组和Ionomycin组的ATF3表达量增加，且主要是细胞核内的ATF3表达增加。同样用LPS和Ionomycin刺激足细胞2h后，提取细胞核蛋白，检测细胞核内ATF3蛋白的表达影响，结果显示与Control组比，LPS组和Ionomycin组细胞核内ATF3蛋白表达明显增高(均P<0.05)(图4)。

辅助转录因子ATF3对核转录因子NFATc1表达的调控作用(1)辅助转录因子ATF3与核转录因子NFATc1的启动子区域直接结合：Ionomycin干预足细胞2h，按照Thermo ChIP试剂盒的操作流程，通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示辅助转录因子ATF3蛋白与核转录因子NFATc1启动子区域有结合(图5A)，且PCR定量分析结果发现与Control组比较，Ionomycin组中核转录因子NFATc1表达量明显增加(P<0.05)(图5B)；(2)辅助转录因子ATF3调控核转录因子NFATc1的转录：用ATF3-siRNA#2转染沉默ATF3后，ATF3-siRNA#2+Ionomycin组NFATc1 mRNA和蛋白均较Ionomycin-24h组表达下降(P<0.05)(图5C～E)。

图3 沉默ATF3对足细胞的保护作用A、B：ATF3-siRNA的效率验证(A为实时定量PCR，B为Western印迹及定量分析)；C～F:细胞流式凋亡图；G、H:凋亡相关标记物BAX、Bcl-2检测(G为实时定量PCR统计图；H为Western印迹及定量分析)；I:细胞流式凋亡定量统计图；J:沉默ATF3对Podocin影响Western印迹及定量分析；组1和C：Control组;组2：Control-siRNA组;组3：ATF3-siRNA#1组;组4：ATF3-siRNA#2组;组5：ATF3-siRNA#3组、组6和D：Ionomycin-24h组;组7和E：Control-siRNA+Ionomycin组;组8和F：ATF3-siRNA#2+Ionomycin组；图A、B中与Control组比较，图G、H、I、J中与Ionomycin-24h组比较，*P<0.05,n=3

图4 LPS和Ionomycin诱导足细胞核ATF3表达 LPS：脂多糖；ATF3：转录激活因子3；Ionomycin:钙离子霉素；A：细胞免疫荧光及定量统计(蓝色为DAPI，绿色为Synaptopodin，红色为ATF3，激光共聚焦显微镜×400)；B：细胞核内ATF3蛋白表达Western印迹及定量分析；组1：Control组；组2：Ionomycin组；组3：LPS组；与Control组比较，*P<0.05,n=3

图5 辅助转录因子ATF3对核转录因子NFATc1的调控作用 ATF3：转录激活因子3；NFATc1:活化T细胞核因子；A：免疫染色质共沉淀(ChIP)后普通琼脂糖凝胶电泳，引物为针对NFATc1的启动子区域序列；B：ChIP后针对NFATc1启动子区域进行的RT-PCR定量分析(A、B两者为不同类型实验)；C、D、E：沉默ATF3表达对核转录因子NFATc1表达影响(C为实时荧光定量PCR，D为Western印迹，E为Western印迹定量分析)；1：input组；2：IgG组：IP-IgG；3：IP组：IP-ATF3；4：Ionomycinl-24h组；5：Control-siRNA+Ionomycin组，6：ATF3-siRNA#2+Ionomycin组；图B中与Control组比较，图C、E中与Ionomycin组比较，*P<0.05,n=3

讨 论

足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，几乎所有的肾小球疾病产生蛋白尿都与足细胞损伤有关[14]。转录激活因子ATF3是应激诱导性辅助转录因子。在细胞静息状态下，ATF3基因低表达，但在一系列应激刺激下(如低氧、缺血)可被诱导表达[15]。ATF3是ATF/CREB转录因子家族的成员[9]，具有bZIP，bZIP是DNA结合位点，可结合其他含bZIP蛋白形成异构复合体来调控转录[10]。因ATF3结合不同的bZIP蛋白，ATF3既可抑制转录，也可活化转录[9]，其在调控细胞增殖、凋亡、炎症、免疫稳态以及器官和组织的分化等方面具有重要功能[11-13,16]。在足细胞中，ATF3的表达和效应尚未有报道。本研究首次发现在人类肾组织的足细胞及体外培养的足细胞中均有ATF3的表达，且在人类慢性肾脏病患者足细胞中表达增加，体外培养的足细胞在损伤刺激下也表达增加。因此猜测ATF3表达变化极可能与足细胞损伤有关，研究表明当足细胞受损时细胞凋亡增加[2]，凋亡相关标记物BAX上调[2]，Bcl-2下调[17]，足细胞标记蛋白Podocin表达下降[18]。进一步探究ATF3在足细胞中的效应发现，沉默ATF3表达后，部分逆转了损伤刺激引起的足细胞凋亡，且凋亡标记物BAX下调、Bcl-2上调及足细胞标记蛋白Podocin表达增加。以上结果表明对于足细胞而言ATF3是一个损伤因子。

为了探究ATF3在足细胞中的损伤作用机制，进一步实验发现，损伤刺激下，ATF3在足细胞核内表达增加。ATF3对足细胞的损伤效应是否与核转录因子NFATc1有关？当细胞受到刺激引起细胞内游离钙离子增加时，钙调磷酸酶(CaN) 活化，催化核转录因子NFAT去磷酸化后进入细胞核，启动目的基因的转录[19]。本课题组[1-4]和国内外研究者[5-7]报道，CaN-NFAT信号轴活化导致足细胞损伤、凋亡和肾小球硬化。临床上，CaN抑制剂(如环孢素A)在绝大多数肾小球疾病，都有显著的降低尿蛋白和保护足细胞的作用，这反映了经典通路CaN-NFAT在肾小球疾病发病机制中的核心地位。同时有研究表明，核转录因子NFATc1具有自身增强效应，除调控自身NFATc1基因[8]，还需要有其他辅助转录因子参与其自身增强效应。为探究辅助转录因子ATF3在足细胞中的损伤效应是否与核转录因子NFATc1有关，我们通过ChIP实验发现，ATF3确实与NFATc1启动子有结合，且在损伤刺激下结合明显增加。沉默ATF3的表达后，NFATc1的表达也减少，可见ATF3可直接调控NFATc1的转录，从而介导足细胞损伤。

本研究首次发现ATF3在足细胞中有表达，且在足细胞中ATF3是一个损伤因子，介导足细胞的损伤机制是通过直接结合NFATc1启动子，增强NFATc1转录活性。本研究从一个全新的视角探究NFATc1的转录调控机制，丰富了CaN-NFAT信号轴机制，为临床治疗慢性肾小球疾病提供新的干预策略。ATF3作为转录因子，是否能直接调控足细胞的凋亡和Podocin的表达改变，或除本研究发现的ATF3-NFATc1信号轴，是否还存在其他信号通路调控足细胞损伤，ATF3是否在内皮细胞或系膜细胞中也表达，后续我们将继续探究相关问题，并构建转基因动物模型，进一步验证ATF3和NFATc1之间的关系及对肾脏损害的影响，从而为ATF3应用于临床提供更多的实验依据。

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Actvatingtranscriptionfactor3modulatesnuclearfactorofactivatedT-cellscytoplasmic1incucedpodocyteinjury

LIANGShun1,ZHANGHong2,DUYue3,ZHANGLiangyou3,HEMin3,LIZhonghe1,LIUShuangxin3,DUYi1,ZHANGBin3

1DepartmentofNephrology,TheFifthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China2SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China3DepartmentofNephrology,GuangdongGeneralHospital,Guangzhou510080,China*LIANGShunandZHANGHongareconsideredtobefirstauthors

ZHANGBin(E-mail:13925056339@163.com);DUYi(E-mail:2412127110@qq.com)

Objective：To explore the role of transcriptional coactivator-activating transcription factor 3(ATF3) in the nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1 (NFATc1) induced podocyte injury.Methodology(1) The expression of ATF3 in the glomeruli of proteinuric patients (MCD, FSGS or DN) were observed by laser confocal microscopy and Western blotting; (2) The conditionally immortalized mouse podocyte cell line was cultured in vitro and exposed to LPS (100 μg/ml) or ionomycin (2 μmol/L) for different times. Real-time quantity PCR and Western blotting were used to analyze the expression of ATF3; (3) Cell apoptosis in ATF3 knockdown podocytes was observed by flow cytometry. Real-time quantity PCR and Western blotting were used to analyze the expression of BAX and Bcl-2, and podocin expression in ATF3 knockdown podocytes was analyzed using Western blotting; (4) Western blotting and immunofluorescent staining were used to evaluate the change of nuclear localization of ATF3; (5) A chromatin immunoprecipitation assay (ChIP assay) was performed to confirm the potential ATF3 binding sites in the NFATc1 promoter region.Results(1) The expression of ATF3 was all elevated in podocytes from MCD patients, FSGS or DN. (2) ATF3 mRNA and protein increased in LPS or Ionomycin-treated podocytes for 1,2,4 hours. Western blot analysis demonstrated that ATF3 activation peaked at 2 hours and diminished 6 hours after LPS or ionomycin treatment. (3) After the knockdown of ATF3, the apoptosis ratio reduced, BAX mRNA and protein was down-regulated, Bcl-2 mRNA and protein was up-regulated, podocin protein increased and recovered to a nearly normal expression. (4) After injury-stimulation, nuclear localization of ATF3 increased. (5) ChIP assay demonstrated ATF3 were binding to the NFATc1 promoter region. When ionomycin-treated, more chromatin immunoprecipitated by ATF3 antibodies was observed. In ATF3 knockdown podocytes, reduced NFATc1 mRNA and protein expression were observed by Real-time quantity PCR and Western blotting.ConclusionATF3, a transcriptional coactivator, promotes the transcription of NFATc1 through binding to NFATc1 promoter region and thus contributes to NFATc1-mediated podocyte injury.

podocytes activating transcription factor 3 nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.06.006

国家自然科学基金面上项目(81570642，81370808，81670656)；国家临床重点专科建设项目

1中山大学附属第五医院肾内科(珠海,519000)；2南方医科大学研究生学院；3广东省人民医院肾内科 广东省医学科学院；梁 顺和张 鸿为共同第一作者

章 斌(E-mail：13925056339@163.com)；杜 艺(E-mail：2412127110@qq.com)

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2017-06-13

(本文编辑 春 江 律 舟)