RP-HPLC法同时测定不同产地女贞子中8个主要成分的含量

易 骏 ，吴建国 ，黄运喜 ，吴岩斌 （.福建教育学院理科部，福建 福州 35005；.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350）

RP-HPLC法同时测定不同产地女贞子中8个主要成分的含量

易 骏1，吴建国2，黄运喜2，吴岩斌2（1.福建教育学院理科部，福建 福州 350025；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122）

目的 建立同时测定不同产地女贞子中羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素8种化学成分的HPLC方法。 方法 采用YMC-Pack ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL／min，检测波长为265 nm，柱温为25℃。 结果 在上述色谱条件下，羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、 芹菜素获良好分离， 分别在 21.3～852、22.6～723.2、21.3～852、25～1000、22.8～273.8、23.9～1074、0.945～9.45和 2.3～27.4 μg／mL 内线性关系良好， 平均回收率分别为 101.43%、100.91%、101.90%、98.86%、99.07%、98.86%、99.17%、102.25%。 结论 该方法简便，重复性好，可以更好地用于女贞子药材的质量控制。

高效液相色谱法；女贞子；特女贞苷；女贞苷G13；含量测定

女贞子为木犀科女贞属植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，主要分布在我国长江流域及南方各地，资源丰富，为国家颁布的保健食品目录中的物品之一，常为药食两用，具有滋补肝肾、乌须明目之功效［1］，作为中药应用已有2 000多年历史。女贞子始载《神农本草经》，是中医常用扶正固本药物，民间用其泡酒以补益肝肾，抗衰祛斑；与桑葚配伍制得桑椹二至膏用于肝肾不足，须发早白；另外，女贞子可作为茶用，如二子菊花饮、二绿女贞茶等，可起到很好的保健效果［2］。环烯醚萜类为女贞子主要活性成分，如特女贞子苷为2015年版《中国药典》定量的品质评价指标成分［1］。但女贞子药效并不是靠个别成分含量决定［3］，女贞子其他活性成分，如苯乙醇类（红景天苷、羟基酪醇和类叶生麻苷）、黄酮类（槲皮素和芹菜素）、环烯醚萜（特女贞苷、橄榄苦苷和女贞苷G13）等因具有抗氧化、抗骨质疏松等活性［3，4］，也逐一被用于女贞子的品质评价［5，6］，但仍然不够完整，通过分析与药效相关的化合物群的含量才能真实反映药材的质量［6］。因此有必要建立女贞子苯乙醇类、黄酮类和环烯醚萜类等多种活性成分群的品质评价方法，用于评价女贞子品质，为规范女贞子生产提供依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 LC-20AT系列高效液相色谱仪（日本岛津公司）；UV检测器（日本岛津公司）；MS105DU电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；DFT-200手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试药 女贞子采自福建、江西、云南、浙江、江苏、贵州、山西、河北、河南、湖北、安徽和山东12个省份，经福建中医药大学中西医结合研究院吴锦忠教授鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实，不同产地女贞子的编号、采集样品地点和时间见表1；羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素为本实验室从女贞子中分离获得，纯度大于98%；色谱乙腈（美国Fisher公司）；甲醇为分析纯；Milli-Q超纯水机（法国 Millipore公司）。

表1 女贞子药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件 YMC-Pack ODS-A色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相组成为 A （乙腈）-B（0.2%甲酸水溶液）；梯度洗脱（洗脱程序见表2）；流速：1.0 mL／min；检测波长：265 nm；柱温：25℃；进样量 20 μL。

表2 梯度洗脱程序

2.2 混合对照品溶液的制备 分别称取羟基酪

醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成对照品储备液，备用。

2.3 供试样品溶液的制备 取女贞子药材粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入80%乙醇 50 mL，密塞，称定质量，回流提取2 h，过滤，滤液 50℃减压浓缩，用80%甲醇定容至25 mL，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。混合对照品及供试品色谱图见图 1。

图1 混合对照品及供试品HPLC色谱图

2.4 标准曲线及线性范围 分别精密移取上述混合对照品溶液，加80%甲醇稀释，稀释成不同倍数，得一系列对照品混合溶液，摇匀。在上述色谱条件下进样分析，以各成分峰面积为纵坐标（y），质量浓度（μg／mL）为横坐标（x），绘制标准曲线，计算回归方程和线性范围。见表3。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.3”项下制备的女贞子供试品溶液（编号6），按“2.1”项下的色谱条件连续重复进样6次，记录峰面积。计算结果显示：羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面积的 RSD值分别为 0.99%、0.36%、0.79%、0.18%、0.17%、0.20%、0.25%、0.54%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验 取同一批女贞子样品（编号6），精密称取 6份，按“2.3”项下处理，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积。计算结果显示：羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面积的RSD值分别为2.69%、1.36%、2.13%、1.556%、2.00%、2.06%、1.37%和1.79%，表明该方法重复性良好。

表3 混合对照品回归方程和线性范围

2.7 稳定性试验 取同一批女贞子样品（编号6），按“2.3”项下处理，按“2.1”项色谱条件，分别于 0、4、8、16、24、48 h 测定，记录峰面积。计算结果显示：羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素峰面积的 RSD值分别为 1.21%、1.47%、2.04%、1.17%、0.97%、2.21%、1.28%、0.97%，表明供试品溶液在 48 h内稳定。

2.8 回收率试验 取已知含有量的样品（编号6），精密称取6份，分别精密加入一定量对照品，按“2.3”项下方法，制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，记录峰面积，计算回收率。回收率结果显示，羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素的平均回收率分别为 101.43%、100.91%、101.90%、98.86%、99.07%、98.86%、99.17%、102.25%，RSD 分别为 2.54%、1.93%、2.47%、1.49%、2.38%、1.06%、2.84%、2.29%，表明 8个化合物的加样回收率良好。

2.9 样品含量的测定 取不同产地的女贞子药材各1 g，精密称取，以“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样 20 μL，按“2.1”项色谱条件下分析测定，每批样品测定3份，以平均值为测定结果，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3）mg／g

3 讨 论

研究表明：女贞子不同采收期特女贞子苷、木犀草素和芹菜素等含量差异较大［2，7］。由于女贞子为女贞干燥成熟果实，我国长江流域及南方各地大多在秋末冬初，女贞子果实才成熟，所以采集时间为同年11-12月份，能更为客观地评价不同产地女贞子品质。

2015年版《中国药典》规定特女贞苷的限量不低于0.70%，在所测16批不同产地的女贞子药材中，有5个产地（湖北恩施、河北保定、浙江台州、安徽合肥和江苏南京）的女贞子药材中特女贞苷的含量低于《中国药典》2015年版含量限度，占31.25%。山西运城和福建福州女贞子药材中女贞苷G13的含量较高，分别为 23.687 mg／g 和 37.001 mg／g，其原因有待进一步研究。课题组前期研究发现：从女贞子中分离的羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素和芹菜素均有不同程度的抗氧化和抗骨质疏松活性［4］，因此建议采用多种活性成分群评价女贞子品质，可较为客观地反映女贞子内在质量。

试验考察了甲醇-水和乙腈-水两个溶剂系统，结果显示乙腈-水系统的分离效果更好。女贞子中含有部分弱酸性的酚类化合物，故分别考察了甲酸、乙酸、磷酸水溶液-乙腈系统，结果显示乙腈-0.2%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，可有效地分离羟基酪醇、红景天苷、类叶生麻苷、特女贞苷、橄榄苦苷、女贞苷G13、木犀草素、芹菜素。

本方法重现性较好，方法相对简单和准确，可用于女贞子药材内在质量评价，为女贞子质量标准控制和规范化生产提供依据。

［1］ 国家药典委员会.中国药典［S］.一部.北京：中国医药科技出版社，2015：46.

［2］ 戴一，贾晓益，汪会.不同采收期女贞子中木犀草素和芹菜素动态变化研究［J］.时珍国医国药，2015，26（2）：461-463.

［3］ 李昌勤，姚辰，朱荣遥，等．基于HPPH、ABTS和FRAP的中药女贞子抗氧化谱效关系研究［J］.中国中药杂志，2016，41（9）：1670-1677.

［4］ HUANG Y X，WU Y B，WU J G，et al.Chemical constituents from ligustrum lucidum differentially promote bone formation and prevent oxidative damage in osteoblastic UMR-106 cells［J］.Lat Am J Pharm，2014，33（2）：258-65.

［5］ 周逸芝，邹立思，刘毅，等．胶束毛细管电泳测定女贞子饮片中 6 种指标成分的含量［J］.中国药学杂志，2014，49（11）：994-998.

［6］ 赵丽敏，卢广英，杨书娟，等．基于酚类成分特征图谱的女贞子质量表征研究［J］.北京中医药大学学报，2016，39（6）：480-488.

［7］ 田志祥，王伟，刘艺，等．不同生长月份女贞子中特女贞苷含量的动态差异［J］.西部中医药，2016，29（3）：37-40.

R284.1

A

1000-338X（2017）06-0032-03

2017-08-25

福建省科技厅引导性项目（2015Y0070）、（2014Y0049）

易骏（1966—），女，副教授，主要从事药用植物资源化学及品质评价研究。

吴岩斌（1982—），男，助理研究员。E-mail：wxsq1@163.com