太子参通过MAPK信号转导通路促进人脐静脉内皮细胞增殖

林少兵 ，蒋宗胜 ，阮君山 ，2，王少明 ，2

（1.福建医科大学省立临床医学院，福建 福州350001；2.福建省立医院中医药分子生物学实验室，福建 福州350001；3.福建医科大学药学院，福建 福州350122）

太子参通过MAPK信号转导通路促进人脐静脉内皮细胞增殖

林少兵1，蒋宗胜3，阮君山1，2，王少明1，2

（1.福建医科大学省立临床医学院，福建 福州350001；2.福建省立医院中医药分子生物学实验室，福建 福州350001；3.福建医科大学药学院，福建 福州350122）

目的 通过太子参及主要成分环肽B（HB）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响，研究其相关作用机制。 方法 CAM鸡胚绒毛尿囊膜实验测定太子参对血管生成的影响；CCK8检测法检测HB对HUVEC的增殖和毒性；划痕实验检测HB对HUVEC增殖和迁移的影响；ELISA检测HB通过影响哪种细胞生长因子影响HUVEC的生长发育；Western Blot测定MAPK信号转导通路中各蛋白的表达，分析其相关作用机制。结果 太子参具有促进血管生成的作用；0～100 μg／mL HB可促进HUVEC增殖；随着时间推移，HUVEC快速地向划痕中间迁移，并且随着HB浓度的增加，HUVEC迁移的速度和强度也随着增强；HB通过影响VEGF的表达促进HUVEC细胞的增殖；HB通过激活MAPK信号转导通路促进HUVEC细胞的增殖。 结论 太子参具有促进血管生成的作用，作用机制与激活MAPK信号转导通路，促进细胞的增殖有关。

太子参；环肽B；人脐静脉内皮细胞；血管生成

血管生成是指从已有毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新血管［1］，主要包括：血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新血管和血管网，是一个涉及多种细胞的复杂过程。血管生成是目前研究热点，涵盖几乎所有临床学科，尤其是心血管和肿瘤领域的研究较为突出［2］。

太子参为石竹科太子参属植物，主要成分为太子参多糖、多种氨基酸和微量元素。有研究表明：太子参具有抗氧化的特性［3］，且对心肌细胞具有一定的保护作用［4］，但当前作用机制尚未明朗。本研究以环肽B（HB）促进人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖为切入点，进一步研究太子参促进血管生成的作用机制，为太子参在血管生成领域提供更合理的用药依据。

1 材 料

1.1 试剂 SPF种鸡蛋（福建省大北农生物技术有限公司）；重组人血管内皮抑制素（商品名：恩度，山东先声麦得津生物制药有限公司）；重组牛碱性成纤维细胞生长因子（商品名：贝复舒，珠海亿胜生物制药有限公司）；HUVEC（上海汉博生物科技有限公司）；HB（成都普瑞法科技开发有限公司）；DMEM基础培养基、血清、双抗（青霉素-链霉素溶液，美国通用医疗生命科学有限公司）；CCKB试剂、Westem Blot试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；VEGF165试剂盒（武汉云克隆有限公司）；FGF2试剂盒（武汉云克隆有限公司）；Erk1／2、Mek1 ／2、Raf-1（上海斯信生物科技有限公司）；β-actin、IgG（H＋L）（北京麦尔泰克科技有限公司）。太子参水提物由福建省立医院制剂室自制。

1.2 培养条件 HUVEC于36.9℃、5%CO2的培养箱中培养，培养基为DMEM基础培养基加15%血清和1%双抗。

2 方 法

2.1 CAM鸡胚绒毛尿囊膜实验测定太子参对血管增殖的影响 配制浓度为2、5、10 mg／mL的太子参水提物。选择表面清洁，蛋壳均质的SPF种鸡蛋，孵育于5%CO2、36.9℃恒温箱。孵蛋至第 8天，酒精消毒蛋壳表面，去除蛋壳，剪除卵壳膜（大概1.5 cm×1.5 cm），制备假气室［5］。将灭菌后的滤纸以1 cm×1 cm的规格剪取，作为载体置于CAM中。制作成功的 CAM 模型分成空白组、低（2 mg／mL）、中（5 mg／mL）、高（10 mg／mL）剂量组，每组 8 个 CAM 模型，做好标记。用微量加样器将0.06 mL药物滴到各组载体中，加完药后用透明胶封闭加药窗，放入5%CO2、36.9℃恒温箱中继续孵育，连续加药3 d。3 d后，由加药窗滴入甲醛∶丙酮＝1∶1的固定液预固定 15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科镊完整剪下CAM中心待观察区域，置于蒸馏水中，吸管吹打CAM，使其舒展开来，立即拍照保存。使用相关软件分析图像，根据管径将血管分类：管径≥0.1 mm为大血管；0.1 mm＞管径≥0.05 mm为中血管；管径＜0.05 mm为小血管。

在确定最适合细胞生长药物浓度后，用同样的方法将制作成功的CAM模型分成空白组、最适合细胞生长药物浓度组、贝复舒组、恩度组，每组8个CAM模型，观察各组药物对血管增殖的影响。

2.2 CCK8检测法检测细胞增殖和毒性 制备HUVEC细胞悬液并计数，稀释细胞悬液，以每孔2 000个HUVEC接种到96孔板中，5%CO2、36.9℃恒温箱培养 24 h 后，以 8 浓度梯度（0、20、30、50、60、80、100、150、200 μg／mL） 6 个复孔的形式加入 HB。 细胞培养48 h后，每个孔加20 μL CCK8试剂，CCK8作用1.5、3、4 h时，在波长450 nm下测各孔吸光度，实验结果取平均值［6］。

2.3 划痕实验检测HB对HUVEC增殖和迁移的影响 用marker笔在6孔板背后划横线，大约每隔0.5～1 cm一道。在6孔板中选4个孔，每孔加入70 μL（约含 5×105个 HUVEC）细胞悬液，放入 5%CO2、36.9℃恒温箱。待细胞铺满板孔，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，用PBS洗去划下的细胞，加入 0、30、60、90 μg／mL HB 组的培养基，放入5%CO2、36.9℃恒温箱。 在 0、6、12、24 h 时拍照，记下划痕的间距。做3次实验，算平均值。

2.4 ELISA检测 VEGF、FGF2的表达情况 将HUVEC 分为 4 组，每组含 0、30、60、90 μg／mL HB，设5个孔，培养24 h。24 h后，用0.25%胰酶消化，离心收集细胞，将收集到的细胞用冷 PBS洗3次，制备PBS细胞悬液。取适量 PBS重悬细胞，用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，反复冻融3次，使细胞溶胀破碎。于 2～8℃ 500 g离心10 min，收集上清备用。根据ELISA试剂盒说明书的操作检测VEGF、FGF2的表达情况。

2.5 Western Blot检测MAPK信号转导通路中蛋白表达情况 取一个培养瓶的细胞，用预冷过的PBS 洗 3 遍，加裂解液 300 μL（RIPA 裂解液∶PMSF＝100∶1），30 min 后，用枪头刮下细胞（此操作在冰上进行），12 000 rpm，冷冻离心 10 min，取上清液200 μL，加入 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 40 μL，98℃高温变性10 min，BCA法检测蛋白含量。SDSPAGE电泳，转膜，加一抗，4℃过夜，TBST洗5次，加二抗，孵育2 h，TBST洗5次，加发光剂ECL化学发光。将胶片扫描存档，凝胶图像分析目标带的光密度值。

2.6 统计学方法 以上实验均重复3次，采用SPSS22.0版本软件进行统计分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用 t检验。

3 结 果

3.1 CAM鸡胚绒毛尿囊膜实验 鸡胚在5%CO2、36.9℃恒温箱正常发育，孵育40个，成功37个，制作成功率为92.5%。空白组CAM膜与载体融合，部分中、小血管贯穿；低剂量组的中、小血管较多，没有大血管，血管呈点状分布，血管增生的范围主要集中在载体边缘0.2 cm内；中剂量组的血管增生最多，平均每个鸡胚有2.1根大血管，中、小血管的密集，血管呈树突状分布，血管增生的范围主要集中在载体边缘0.5 cm内；高剂量组的鸡胚在加药后死亡2个，基本没有大、中血管，有大量细小血管围绕，细小血管以载体为中心呈包绕或放射状分布。因此最适合细胞生长药物浓度组为中剂量组。

贝复舒组血管增生最多，大、中血管比较多，每个鸡胚有2～4根大血管，呈树突状分布，血管增生的范围主要集中在载体边缘0.8 cm内；恩度组抑制作用非常明显，鸡胚只存活2个，且存活鸡胚的血管多为零星分布的细小血管。如表1所示，中剂量组与空白组比较，血管数有显著性差异（P＜0.05），说明太子参有促进血管生成的作用。

表1 各药物组与空白组血管数比较（x±s） 根

3.2 CCK8检测法检测HB对HUVEC的增殖和毒性 实验显示HB影响HUVEC的增殖，如图1所示：0～100 μg／mL HB 促进 HUVEC 增殖，150、200 μg／mL HB抑制细胞的生长。

3.3 HB促进HUVEC增殖和迁移 如图2、表2所示，随着时间的推移，HUVEC快速地向划痕中间迁移，并且随着HB浓度增加，HUVEC迁移的速度和强度也随着增强，与空白组比较，愈合程度有显著性差异（P＜0.05）。

3.4 HB通过增加VEGF的表达促进HUVEC细胞增殖 如图3所示：随着HB浓度的增加，VEGF的表达随着增加，不同浓度间VEGF的表达有显著性差异（P＜0.05），FGF2的表达不受环肽 B浓度影响。

图1 不同浓度HB作用后测得的HUVEC吸光度值

表2 不同浓度HB在不同时间划痕的愈合程度（x±s）%

图2 不同浓度HB在不同时间划痕的愈合程度

图3 ELISA检测VEGF、FGF2的表达情况

3.5 HB 激活 MAPK（Ras／Raf／Mek／Erk）信号转导通路促进 HUVEC细胞增殖 Ras／Raf／Mek／Erk信号转导通路作为MAPK众多信号通路中的一个，是细胞生长发育最重要的信号转导通路之一，参与HUVEC细胞生长、转移等过程。本实验检测了HUVEC 细 胞 中 Kras、Raf-1、Mek1 ／2、Erk1／2 的 表达水平，结果如图4所示：随着HB浓度的增加，HUVEC 细胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表达水平显著增加，与空白组比较，有显著性差异（P＜0.05）。

图 4 HUVEC 细胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表达情况

4 讨 论

应用药物刺激小血管生长，促进血管生成，已成为目前心血管领域的研究热点之一。CAM是鸡胚外的一层膜，主要功能是提供气体交换的表面，其功能依赖于致密的血管网支撑，正是由于鸡胚发育过程中大量尿囊膜血管的形成，为研究血管发生和形成提供了良好的模型［7］。本研究表明：太子参能促进血管内皮细胞的增殖、迁移，且作用比较缓和，此结果为太子参治疗相关疾病提供新的依据。

血管生成过程复杂，与多种细胞因子有关。目前，对促进血管生成的血管生成因子研究最多的为FGF和VEGF。本研究利用ELISA的敏感性、高特异性检测HB对HUVEC中FGF和VEGF的影响情况，证明HB是通过影响VEGF的表达促进HUVEC细胞的生长发育。

目前已知，所有真核细胞中均存在Ras／Raf／Mek／Erk这一信号转导通路，VEGF、源生长因子（PDGF）等与其受体结合后，可通过刺激 Ras-二磷酸鸟苷（GDP）转换为 Ras-三磷酸鸟苷（GTP），从而导致Ras激酶过度活化，进而以这种自体磷酸化方式激活 Ras／Raf／Mek ／Erk 信号通路［8］，启动相应转录子的转录，进而导致细胞的增殖分化。本文通过测定 Ras／Raf／Mek／Erk 这一信号转导通路中各蛋白的表达水平，结果显示：随着HB浓度的增加，各蛋白的表达水平也随着增加，说明HB通过Ras／Raf／Mek／Erk这一信号转导通路促进HUVEC细胞的增殖。但各蛋白的表达水平并不呈规则的趋势上升，考虑其不只是影响 Ras／Raf／Mek／Erk 这一信号转导通路，还通过其他信号转导途径促进HUVEC细胞的增殖，这需要更多的研究予以证实。

［1］ 殷沈华，唐德才.益气活血类中药对血管生成影响的研究［J］.时珍国医国药，2013，24（1）：43-44.

［2］ KERBEI R S.Tumor angiogenesis：past，present and the near future［J］.Carcinogensis，2000，21（3）：505-515.

［3］ 晏春耕.药用植物太子参的研究及其应用［J］.现代中药研究与实践，2008，22（2）：61-65.

［4］ 沈祥春，彭佼，喻斌，等.太子参对急性心肌梗死心力衰竭大鼠心肌重构的作用［J］.贵阳医学院学报，2008，33（6）：12.

［5］ ZHANG S C，WU Z K，WANG L，et al.A pplication of chicken chorioallantoic membrane as a model for study of effects of Chinese medicine on angiogensis［J］.China J Basic Med Tradit Chin Med，1999，5（5）：16-18.

［6］ 刘艳秋，张可华，王运良，等.CCK-8和MTS法检测人羊膜上皮细胞增殖的比较［J］.中国康复理论与实践，2012，18（9）：827-830.

［7］ ZHU CUI-LING，ZHU YUAN-YUAN.Effects of Leeches on Angiogenesis of CAM［J］.China Journal of Chinese Medicine，2011，155（4）：64-66.

［8］ ZHAO X，TIAN C，PUSZYK W M，et al.OPA1 downregulation is involved in sorafenib-induced apoptosis inhepatocellular carcinoma［J］.Lab Invest，2013，9（3）：8－19.

R285.5

A

1000-338X（2017）06-0016-04

2017-09-18

国家自然科学基金面上项目（81273647）；福建省自然科学基金项目（2013J01365）；福建省卫生系统中青年骨干人才重点项目（2015-ZQN-ZD-2）；国家卫计委共建科学研究基金项目（WKJ-FJ-19）

林少兵（1983—），男，主管药师，主要从事药学工作。

王少明（1958—），男，主任药师，硕士研究生导师。E-mail：cnfjwsm@163.com