ε-聚赖氨酸与卵白蛋白间相互作用及对抑菌活性的影响

谭之磊，武雅楠，方思棋，孙晓光，梁 丽，郭凤柱，贾士儒，周 斌

（1.天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.浙江新银象生物工程有限公司，浙江 台州 317200）

ε-聚赖氨酸与卵白蛋白间相互作用及对抑菌活性的影响

谭之磊1，武雅楠1，方思棋1，孙晓光1，梁 丽1，郭凤柱1，贾士儒1，周 斌2

（1.天津科技大学生物工程学院，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.浙江新银象生物工程有限公司，浙江 台州 317200）

为表征带正电ε-聚赖氨酸与带负电卵白蛋白间的相互作用以及相互作用对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响，本实验通过测定ε-聚赖氨酸与卵白蛋白复合溶液的ζ-电位和浊度，对ε-聚赖氨酸与卵白蛋白之间的相互作用进行了表征。通过抑菌实验研究ε-聚赖氨酸与卵白蛋白之间的相互作用对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响。结果表明卵白蛋白可与ε-聚赖氨酸形成带不同电荷的复合物，进而导致ε-聚赖氨酸对大肠杆菌的抑菌效果下降，这可能是由于ε-聚赖氨酸与卵白蛋白分子之间发生静电结合，减少了其与带负电微生物表面间的相互作用。本研究初步建立了ε-聚赖氨酸与卵白蛋白及大肠杆菌之间的相互作用模型，有利于进一步揭示在复杂食品体系中ε-聚赖氨酸与蛋白质的相互作用及其对ε-聚赖氨酸抑菌活性的影响。

ε-聚赖氨酸；卵白蛋白；静电结合；抑菌活性；蛋白质

ε-聚赖氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）是一种由赖氨酸单体通过ε-氨基和α-羧基形成酰胺键聚合而成的均聚物，因具有安全性高、抑菌谱广、水溶性和热稳定性好等特点，被日本、美国、韩国等多个国家用作食品防腐剂，2014年我国国家卫生和计划生育委员会批准ε-PL及ε-PL盐酸盐作为食品防腐剂使用[1-7]。虽然ε-PL在实验室培养基中对革兰氏阳性菌、阴性菌及真菌均表现出良好的抑菌效果[8-12]，但在实际应用时发现ε-PL对不同食品的抑菌效果不尽相同。Geornaras等[13]研究了ε-PL对于不同食物提取物的抑菌效果，结果表明ε-PL对米饭和蔬菜提取物的抑菌效果要好于高蛋白的牛乳、牛肉和腊肠提取物抑菌效果。Islam等[14]研究表明ε-PL处理可以降低蔬菜肠炎沙门氏菌数量。Kang Jihun等[15]研究了乳酸链球菌素、精氨酸月桂酸、ε-PL和壳聚糖对三文鱼单核球增多性李斯特菌的抑制效果，结果表明ε-PL抑菌效果较差。吴勤等[16]研究发现ε-PL在蓝莓汁饮料中抑菌活性受到影响，ε-PL抑菌率降低，并且出现了小颗粒，影响了产品感官品质。虽然ε-PL在部分食品，尤其是淀粉类食品防腐应用中取得了良好效果，但食品是一个多组分共存且存在相互作用的复杂体系；而ε-PL具有聚阳离子特性，可能与食品组分中的带负电物质如阿拉伯胶、果胶、卡拉胶、羧甲基纤维素钠等发生相互作用，改变其带电性质，导致浊度改变、形成沉淀并对其抑菌活性产生影响[17-20]。虽然通过其他防腐剂复配或与气调包装等技术手段相结合可以提高ε-PL在食品中的抑菌效果[21-23]，但对于ε-PL与食品中其他组分间的相互作用，尤其是食品中含量丰富的蛋白质成分间的相互作用机制还不清楚，因而也难以采取更有效的技术手段提高ε-PL在富含蛋白质类食品中的抑菌效果。

大肠杆菌是人和恒温动物中常见的肠道共生微生物[24-25]，在世界各地动植物产品中广泛分布[26-29]。在肉和肉制品等富含蛋白质食品加工过程中很容易受到大肠杆菌污染[29]，从而引发食源性疾病，此外，对大肠杆菌的抑制能力也是评估抗菌活性的重要指标[30]，因而本实验以大肠杆菌为指示微生物，通过ζ-电位测定、浊度测定和抑菌实验研究了ε-PL与食品中重要组分——蛋白质间的相互作用。研究结果有助于揭示ε-PL与食品中其他组分的分子间相互作用机制，另一方面可进一步探讨如何通过技术手段提高ε-PL在食品复杂体系中的抑菌效果，进而提高产品质量，保证食品安全。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）由天津科技大学生化工程实验室保藏。

ε-PL盐酸盐 浙江新银象生物工程有限公司；卵白蛋白 加拿大BBI公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

90Plus型激光粒度仪 美国布鲁克海文仪器公司；UVmini-1240型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；CX40RF200型显微镜 日本奥林巴斯光学工业株式会社；FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制备

以柠檬酸缓冲液（0.5 mmol/L、pH 6.6）为溶剂，分别制备1.0 g/100 mL ε-PL和0.1 g/100 mL卵白蛋白溶液，过0.45 μm无菌滤膜除菌，4 ℃冷藏保存。实验所需溶液均使用去离子水配制。

1.3.2 卵白蛋白与ε-PL的质量比对ζ-电位的影响

取1.3.1节所配溶液，制备卵白蛋白与ε-PL的质量比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、0∶1和1∶0的混合液。将复合溶液混匀后，立即进行ζ-电位测定。

1.3.3 卵白蛋白与ε-PL的质量比对浊度的影响

卵白蛋白与ε-PL复合溶液的质量比同1.3.2节，使用紫外-可见分光光度计测定复合溶液的OD600nm。将复合溶液置于4 ℃下保存24 h后，再次测定OD600nm，测定前将溶液混合均匀。

1.3.4 抑菌实验

将保藏于斜面的大肠杆菌转接于新制备的LB固体斜面培养基，37 ℃过夜培养，将活化好的大肠杆菌接入LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min培养8 h。

制备卵白蛋白与ε-PL不同质量比的复合溶液，其中卵白蛋白（0.5 g/100 mL、pH 6.6）与ε-PL（2.0 g/100 mL、pH 6.6）的质量比分别为4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、0∶1、1∶0，以不添加复合溶液的LB培养基为空白对照组。按上述比例分别向锥形瓶中加入8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.0 mL卵白蛋白储备液和0.5 mL ε-PL，纯卵白蛋白一组加入20 mL卵白蛋白。分别加入10 mL已灭菌的LB培养基，摇匀，接入0.5 mL上述大肠杆菌菌液，37 ℃、180 r/min摇瓶培养6 h后，测定各组菌悬液OD600nm，并用光学显微镜观察菌体生长和分布状态。

1.4 数据处理

所有实验重复测定3 次，结果运用Origin 8.5软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 ε-PL与卵白蛋白相互作用后ζ-电位的变化

实验结果表明，当溶液中只含有卵白蛋白时，ζ-电位为-20.03 mV，卵白蛋白的等电点约为4.5，溶液pH值为6.6，故其带负电荷。卵白蛋白与ε-PL质量比为零时，即复合溶液中只含有ε-PL时，其ζ-电位为0.985 mV，ε-PL的等电点约为9.0，而溶液pH值为6.6，故其带正电荷。

图1 不同卵白蛋白与ε-PL质量比对混合液ζ-电位的影响Fig. 1 Effect of ovalbumin-ε-PL complex solution with different mass ratios on ζ-potential

由图1可知，ζ-电位随卵白蛋白比例的增加而降低，当卵白蛋白与ε-PL的质量比从0∶1到1∶8时，其复合物的电位由0.985 mV下降至-4.065 mV，质量比由1∶4变为1∶1时，其复合物的电位由-4.18 mV继续下降至-5.22 mV，但变化幅度不大，这可能是由于ε-PL所带正电荷与卵白蛋白所带负电荷相互作用后，复合物所带电荷达到了相对饱和的状态。结果表明：在pH 6.6条件下带正电荷的ε-PL与带负电荷的卵白蛋白发生相互作用，形成带负电荷的复合物，且随着卵白蛋白比例增大，ζ-电位降低趋势逐步减缓。

2.2 ε-PL与卵白蛋白相互作用后浊度的变化

图2 卵白蛋白与ε-PL质量比对混合液浊度的影响Fig. 2 Effect of ovalbumin-ε-PL mass ratio on turbidity of mixture solutions

图3 卵白蛋白与ε-PL复合物溶液0 h（A）和 24 h（B）视觉外观Fig. 3 Visual appearance of ovalbumin-ε-PL complex solutions at 0 h (A) and 24 h (B)

由图2可知，随着卵白蛋白比例的增加，ε-PL与卵白蛋白复合溶液的OD600nm逐渐增大，当卵白蛋白与ε-PL的质量比为1∶1时，其OD600nm达到最大值0.25，由图3A可观察到其浑浊程度的变化。这表明ε-PL与卵白蛋白发生相互作用，在短时间内ε-PL可能与卵白蛋白复合形成了比ε-PL分子更大的复合物，且随着卵白蛋白质量浓度的增加，ε-PL与卵白蛋白复合物分子的数量和/或大小增加。

对置于4 ℃下保存24 h后的复合溶液再次进行浊度测定，测定前将复合溶液振荡混匀，由图2、图3B可知，随着卵白蛋白比例的升高，其OD600nm缓慢增加至0.069。与0 h测定的OD600nm相比，卵白蛋白与ε-PL质量比从0∶1变为1∶4时，24 h时浊度没有明显变化；但当其质量比从1∶4增加至1∶1时，其浊度与0 h相比出现明显下降。

从图3B可观察到，当卵白蛋白与ε-PL质量比为1∶1、1∶2和1∶4时，复合液中形成了比较明显的不溶性复合物，造成聚沉，溶液变得澄清，且随着卵白蛋白比例的升高，其复合物的大小和/或数量增加，因此当其质量比1∶4变为由1∶1时，其浊度较0 h明显下降，且下降程度逐渐增加。而卵白蛋白与ε-PL质量比为1∶8和1∶16时，其复合溶液较为澄清，没有形成明显不溶性复合物沉淀，因此其浊度无明显变化，这可能是由于卵白蛋白含量低，ε-PL与卵白蛋白相互作用形成的复合物分子质量较小，不足以形成聚沉。

2.3 卵白蛋白-ε-PL复合物的抑菌活性

图4 卵白蛋白与ε-PL不同质量比对抗菌活性的影响Fig. 4 Effect of ovalbumin-ε-PL mass ratio on antibacterial activity

由图4可知，当培养基中无ε-PL和卵白蛋白添加，只添加菌液时，其0 h的OD600nm为0.031，37 ℃、180 r/min下培养6 h后，其OD600nm为1.608。当培养基中卵白蛋白和ε-PL的质量比为0∶1时，0 h时OD600nm为0.032，培养6 h后其OD600nm为0.054，由此可见，单纯的ε-PL起到了良好的抑菌效果。

培养6 h后，当卵白蛋白与ε-PL的质量比从0∶1变为1∶1时，菌液OD600nm从0.054增加至1.468，随卵白蛋白的增加呈上升趋势，即随着卵白蛋白与ε-PL质量比的增加，ε-PL的抗菌活性下降。这可能是由于ε-PL所带正电荷与卵白蛋白所带负电荷发生相互作用，减少了ε-PL与大肠杆菌菌体表面相互作用的机率，从而导致ε-PL抑菌活性的下降，且随着带负电卵白蛋白的增加，ε-PL与其相互作用增强，菌液OD600nm呈上升趋势。

根据推测，随着卵白蛋白比例的升高，ε-PL的抑菌活性下降，菌液OD600nm应呈上升趋势，然而，当卵白蛋白与ε-PL质量比从1∶1变为4∶1时，菌液OD600nm出现下降趋势。对此，推测这可能是卵白蛋白与ε-PL形成的复合物包裹了部分菌体，从而导致菌液中部分菌体呈聚集状态。

图5 卵白蛋白-ε-PL复合物处理后E. coli生长情况的光学显微镜图片（×1 000）Fig. 5 Representative light microscopic pictures showing the growth of E. coli after being treated with ovalbumin-ε-PL complex (× 1 000)

为了证实推测的可靠性，将培养好的菌液取样进行结晶紫染色后，在光学显微镜下观察了大肠杆菌菌体数量与分布状态。由图5B～E可知，卵白蛋白与ε-PL质量比从0∶1变为1∶1，视野内菌体数量逐渐增加，且发生一定聚集现象，而纯卵白蛋白处理组（图5H）与空白对照组（图5A）菌体分布状态基本一致，表明卵白蛋白与菌体间基本不发生相互作用。从图5F、G可观察到蛋白质与ε-PL相互作用形成大块胶状聚集体，且胶状聚集体包裹着大量菌体，聚集体外分散菌体数量减少，这种絮凝作用可能与同样带正电荷的壳聚糖可作为絮凝剂去除菌体细胞相似[31]，这也就解释了菌液OD600nm出现下降的原因。

2.4 ε-PL与卵白蛋白及与微生物的相互作用模型

综合前面关于ε-PL-卵白蛋白复合物的聚合特性和带电特性的讨论，推测当卵白蛋白与ε-PL质量比从0∶1变为1∶1时，ε-PL与卵白蛋白相互作用增强，ε-PL-卵白蛋白复合溶液浊度逐渐增加，其复合物的ζ-电位逐渐下降，所带负电荷增加，ε-PL与菌体表面相互作用减少，导致菌液OD600nm增加，ε-PL抑菌活性下降。

根据上述推测，提出以下ε-PL与卵白蛋白及菌体相互作用的模型，见图6。

图6 卵白蛋白-ε-PL-微生物相互作用模型Fig. 6 Schematic diagram of the interaction of ε-PL with ovalbumin and the bacterial surface

图6为pH 6.6环境下ε-PL与卵白蛋白及微生物相互作用示意图。当体系中无卵白蛋白时，ε-PL与大肠杆菌菌体表面带负电物质相互作用，进而起到抑菌作用；当体系中有少量卵白蛋白存在时，部分ε-PL与卵白蛋白相互作用，游离ε-PL数量减少，抑菌作用减弱；当卵白蛋白量继续增加时，抑菌作用继续减弱，当卵白蛋白数量足够多时，ε-PL、卵白蛋白与大肠杆菌菌体形成聚集体，ε-PL抑菌效果基本消失。

3 结 论

对ε-PL与卵白蛋白相互作用及其对ε-PL抑菌活性的影响研究结果表明在pH 6.6的环境下，ε-PL带正电荷，卵白蛋白带负电荷，卵白蛋白会与ε-PL相互作用，进而导致复合溶液的ζ-电位和浊度发生变化。ε-PL与卵白蛋白相互作用后会不同程度降低ε-PL的抑菌活性，当卵白蛋白与ε-PL质量比从0∶1变为1∶1时，ε-PL的抑菌活性逐渐下降，当其质量比大于1时，ε-PL与卵白蛋白相互聚结成较大团块，同时会包裹菌体，从而使OD600nm有一定程度下降。

根据上述实验结果，初步建立了ε-PL与卵白蛋白及微生物间相互作用的模型，对ε-PL阳离子和卵白蛋白之间相互作用进行了解释，并分析了这些相互作用对ε-PL抗菌活性的影响。实验结果对深入揭示ε-PL在富含蛋白质组分食品中抗菌活性差的作用机制，解决今后ε-PL在食品尤其是高蛋白含量食品中的应用问题提供了借鉴，有望通过控制pH值等手段提高ε-PL在高蛋白含量食品中的抑菌效果。

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Interaction of ε-Poly-L-lysine with Ovalbumin and Its Inf l uence on Antibacterial Activity

TAN Zhilei1, WU Yanan1, FANG Siqi1, SUN Xiaoguang1, LIANG Li1, GUO Fengzhu1, JIA Shiru1, ZHOU Bin2
(1. Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Bioengineering,Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;2. Zhejiang Silver Elephant Bioengineering Co. Ltd., Taizhou 317200, China)

The purpose of this study was to characterize the interaction of cationic ε-poly-L-lysine (ε-PL) with anionic ovalbumin and investigate the influence of this interaction on the antimicrobial efficacy of ε-PL. The interaction was characterized by measuring the ζ-potential and turbidity of ovalbumin-ε-PL complex solution. The results showed that ovalbumin interacted with ε-PL molecules, forming complexes with different electrical charges. In addition, the antimicrobial eff i cacy of ε-PL against Escherichia coli decreased, likely due to strong electrostatic binding of ε-PL to ovalbumin molecules and consequently reducing its interaction with the negative charge on the of microbial surface. The model of ε-PL interaction with ovalbumin and bacteria proposed in this study helps further reveal the interaction of ε-PL with protein and the inf l uence of this interaction on the antimicrobial eff i cacy of ε-PL in complex food systems.

ε-poly-L-lysine; ovalbumin; electrostatic binding; antibacterial activity; protein

10.7506/spkx1002-6630-201801011

TS201.3

A

1002-6630（2018）01-0073-05

谭之磊, 武雅楠, 方思棋, 等. ε-聚赖氨酸与卵白蛋白间相互作用及对抑菌活性的影响[J]. 食品科学, 2018, 39(1): 73-77.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201801011. http://www.spkx.net.cn

TAN Zhilei, WU Yanan, FANG Siqi, et al. Interaction of ε-poly-L-lysine with ovalbumin and its inf l uence on antibacterial activity[J]. Food Science, 2018, 39(1): 73-77. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201801011.http://www.spkx.net.cn

2016-10-06

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2013AA102106）；天津市科技特派员项目（15JCTPJC59700）；国家自然科学基金面上项目（21276197）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD16B04）；国家级大学生创新创业训练计划项目（201510057006）

谭之磊（1977—），男，副研究员，博士，研究方向为食品添加剂。E-mail：tanzhilei@tust.edu.cn