块根块茎类植物细胞悬浮培养技术与应用

李鑫　李炎林　李清明　李文佳　苏小军

摘要：植物细胞悬浮培养已广泛用于生产次生代谢物，如多糖、皂苷、生物碱、黄酮类及多酚等物质。本文综述了国内外块根块茎类植物细胞悬浮培养体系，内容涉及悬浮体系方法、技术及其应用领域等方面，同时初步讨论大规模生产次生代谢物问题。

关键词：块根茎类植物；细胞悬浮培养；次生代谢物

植物细胞悬浮培养是将植物活体组织或离体组织培养物如愈伤组织、胚状体等转至合适的液体培养基中，置于特定转速的摇床上进行振荡悬浮培养，经过周期的继代培养和筛选后形成稳定均一的悬浮细胞系。植物细胞由于其分散性好、细胞形状及细胞团大小大致相同，而且生长迅速、重复性好、易于控制等有利因素，被广泛用于细胞学、生理学、分子生物学、发育生物学及遗传学、生物化学的研究。它不仅可直接用于原生质体分离、培养与杂交、基因转移和生产次生代谢物等，还可短期内在细胞水平筛选出预期突变体，因此，细胞悬浮培养已成为植物生物技术中最有用的手段之一。

块根块茎类植物广泛存在于大自然中，主要包括马铃薯、淮山、半夏、盾叶薯蓣、何首乌、人参、甘草、姜等品种，且多是药食兼用植物，这类植物根茎内含有多种次生代谢物，如多糖、皂苷、生物碱、黄酮类及多酚等物质。近年来植物离体培养技术愈发成熟，利用植物细胞悬浮培养技术有效获取代谢产物是一大研究热点，但能实现大规模生产的植物不多。本文笔者对近年来国内外对块根块茎类植物细胞悬浮培养进行了综述，内容包括悬浮培养影响因子、方法和技术，应用领域涉及突变体选取、次生代谢物提取和生物学研究；同时探讨了工业化大规模生产次生代谢物存在问题及其建议。

1植物细胞悬浮培养技术

1.1悬浮体系影响因子

悬浮培养技术在植物次生代谢物大规模培养中得到了广泛的应用。国内外在此方面已经取得很大进展。因此，了解影响悬浮培养的影响因子，对快速、准确建立高质量的悬浮体系具有重要意义。

1.1.1外植体选取。对于不同的植物，外植体选择差异较大。块根块茎类植物一般选择用叶片、茎尖、芽尖、胚根等作为外植体。选择合适的外植体，才能得到胚性愈伤率和再生率较高的再生体系，在胚性愈伤率较高的基础上更容易快速建立起高频再生的悬浮细胞系。

1.1.2愈伤组织诱导。块根块茎类植物愈伤组织的诱导差异较大，一般植物外植体经诱导后通常可产生3种类型的愈伤组织：①质地坚硬、块状、颜色鲜黄的胚性愈伤组织；②柔软、水渍、形状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤组织；③质地疏松、易分散、不分泌粘液的颗粒状胚性愈伤组织。通过对愈伤组织有利诱导，为细胞悬浮培养提供良好的基础，有利于次生代谢物分泌。

1.1.3培养基成分。基本培养基主要是无机盐，而不同科属的植物对营养物质的需求不尽相同，所以在植物细胞悬浮培养时，对无机盐的种类及浓度要求也有所不同。植物主要常用的培养基有White、Heller、MS、ER、B5及N6等几种。

培养基为块根块茎类植物细胞悬浮培养提供营养物质，对植物组织生长、细胞分化和次生代谢产物积累等具有重要作用。其内营养成分主要包括碳源、氮源、有机物质、无机养分、外源激素或生长调节剂等。

1.2悬浮培养方法和技术

植物细胞培养是在离体条件下，以单细胞或细胞团为单位进行植物组织离体培养。该技术不受外界条件和性状分离等影响，可在较短时间内大规模培养出较均匀的细胞，便于后续研究与利用。同时植物细胞需较长的培养过程，需要长时间保持无菌条件，培养过程中易造成污染且细胞常发生变异。植物细胞在悬浮培养时对氧的需求量较低，但由于植物细胞培养后期密度高、粘度大，氧的传输会受到阻碍，因此与微生物相比，在达到同样浓度时，氧传递速率要小得多。另外，植物细胞易于粘附成团使搅拌不匀而导致营养物质的传输受到限制，因而其二次代谢途径更加复杂。

悬浮培养根据其培养方式可分为分批培养和连续培养2种类型。分批培养是把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，目的是获得细胞悬浮培养物；连续培养是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养不同的培养方法，其反应器选择也有差异。反应器规模能否放大是选择反应器的一个重要前提，悬浮培养规模的放大主要通过增加反应器体积或者增加反应器数量，增大反应器可以节省大量的配套工程及人员成本，而多台小的反应器虽然操作灵活，但成本相对高。目前国内外用于植物细胞悬浮培养的反应器主要有搅拌式、鼓泡式、气升式、振动混合式，此外还有植物固定化培养生物反应器、光生物反应器及一次性生物反应器等。

选择和配置生物反应器还需考虑和满足生产工艺和产能需求。反应器接口的标准化、配件提供速度及售后服务质量等，均应作为工业化选用生物反应器考虑的因素，以免造成生产的延误n珂。总之，在重视植物資源保护及有效利用的今天，合理利用植物细胞生物反应器培养技术来大规模生产植物中有效成分具有重要意义。

2植物细胞悬浮培养应用领域

通过植物细胞悬浮培养技术，利用悬浮细胞系主要应用有：①选择突变体，离体的单倍体体细胞可以提供一种突变体选择系统，在很小的空间就可以操作大量潜在的植株。通过单细胞培养，可以在细胞水平上筛选出需要的突变细胞系，再生成理想的植株。②生产天然植物成分，悬浮培养物某些次生化合物含量往往比植物体高出2～5倍，通过植物细胞离体培养生产这些化合物，或利用培养细胞对外供前体化合物或中间产物进行生物转化。③原生质体分离、培养与杂交，悬浮细胞是分离原生质体较理想的材料。④细胞生物学研究的工具，利用悬浮细胞进行多方面细胞生物学研究。本文概述了块根块茎类植物突变体选取、次生代谢物提取、生物学研究及开发新产品等方面。

2.1突变体选取

块根块茎类植物种类繁多，植物离体培养选取突变体方式也不一样。经报道潘梅等为选取优质幼苗，以山药幼嫩茎段进行离体培养，发现芽诱导最好培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭1.0g/L，组培苗移栽适宜基质是V河抄：V椰糠：V珍珠岩=2：1：1。而Eun等选取MS+NAA 5.4μM+BA 4.44μM对半夏进行悬浮培养大量繁殖试管块茎，测定试管块茎琥珀酸发现，含量最高达45g/kg，近乎于野生半夏琥珀酸含量，因此体外培养半夏试管块茎，是一种选择半夏块茎突变体方法。Mingjun Li等进行山药体外培养生产试管块茎试验，最优培养基为MS+KT 0.5rag/L+2，4-D0.1mg/L+PP₃₃₃ 0.1mg/L及60g/L蔗糖，每个植株可生产2～3个试管块茎，大大加速了山药繁殖。

2.2次生代谢物提取

植物细胞悬浮培养能高效合成许多重要价值的次生代谢物，传统提取这些产物方式均是从天然植物中获取，但天然植物生长周期长，其生长受地域和环境因素影响较大，利用植物细胞悬浮培养能够极大地弥补这些缺陷。

选择合适培养基进行细胞悬浮有利于次生代谢物分泌。杨帆等发现添加2mg/L 2，4-D+1mg/L NAA的MS培养基最适合马铃薯‘底西瑞悬浮细胞生长，细胞的最佳接种量为7.5mL/50 mL。张丹等建立人参悬浮细胞系，研究碳源、氮源、磷源及植物生长调节物质对其影响，结果表明：MS+2，4-D 2.0mg/L+NAA2.0mg/L+BA 0.4mg/L为最适培养基，接种量10g，100mL，19%，100r/min转速条件下，人参悬浮细胞系生物量积累最大。Ewa等采用MS+2，4-D 1mg/L+NAA 1mg/L+BAP 0.5mg/L+50mg/L蔗糖液体培养基，利用细胞悬浮培养研究了西洋参6种皂苷的生物合成，发现在培养25～30d之后，人参皂苷达到最高接近30mg/g·dw，但在各个生长时期皂苷的积累与生物量增加是不成比例的，在生物量快速增加达到90%时，仅有一半人参皂苷被检测到，另一半皂苷在生物量缓慢增长阶段被积累。Narges等通过诱导元参愈伤组织及建立细胞悬浮体系，在体外生产阿克替苷。选取MS+NAA 0.5mg/L+BA 2.0m/L诱导愈伤组织，且诱导率达到100%，生长最好愈伤组织中阿克替苷鲜重含量达到1.6μg/g。选取松散的、生长较好的愈伤组织进行继代培养，在培养17天后阿克替苷达到最大鲜重含量为14.25μg，g。Latiporn等进行野葛根细胞悬浮培养获取葛雌素、脱氧微雌醇及异黄酮，选取茎段愈伤组织在MS+TDZ 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+BA 1.0m/L中进行试验，检测色烯和异黄酮干重含量分别为184.83±20.09μg，9、20.72±2.38mg/g。同时对不同碳源进行研究，发现在野葛根细胞悬浮培养中选取蔗糖有利于生物量积累，而果糖有利于脱氧微雌酮和异黄酮分泌。

此外，一定程度诱导也有助于次生代谢物增加。陶兴魁等对不同浓度EMS溶液对半夏悬浮细胞系进行诱变处理，及耐高温突变体筛选表明，半夏试管苗在高温胁迫下，叶片内游离脯氨酸含量升高，积累速度和积累量明显高于对照组，可以把脯氨酸含量作为半夏抗高温的生理指标之一。卞爱华等发现在甘草细胞悬浮培养中，添加水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高盐、超声等诱导子有助于提高甘草酸含量。

2.3生物学研究

对于大多数块茎类植物而言，直接提取次生代谢物含量较低。随着离体培养技术愈发成熟，近年来利用植物细胞悬浮培养进行生物学研究也取得一定成效。Eng等采用MS+2，4-D 2mg/L+NAA 1mg/L+BAP 1mg/L进行凹唇姜细胞悬浮培养，采取蛋白质组学分析经苯丙氨酸诱导的提取物，发现了黄酮类化合物及苯丙素类的生物合成方式。同时许多研究者进行动物试验方面报道，Man～n等通过甘草悬浮培养产生的黄酮类化合物及少量三萜烯，与栽种甘草中活性成分对二甲苯诱导小鼠水肿的抗炎效果对比，发现抗炎效果相差无几。Tanatorn等研究茉莉酸甲酯对野葛根细胞悬浮培养产生异黄酮和抗氧化物酶的影响，表明茉莉酸甲酯浓度为1.0μg/mL时，异黄酮含量最高，同时超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶在细胞中活动水平均增强，而过氧化物酶减弱。因此野葛根细胞有抵御超氧化物和过氧化氢压力的机制。Tanatornm 等选取细胞悬浮培养（PMC）和块茎根（PMT）获取野葛根黄酮类化合物，结果表明：切除卵巢的老鼠试验，PMT刺激雌激素活动强于PMC；体外抑制破骨细胞试验，PMT和PMC提取物均能抑制抗破骨细胞活动；DPPH法测定IC50值，PMT低于PMC。

2.4其他

塊根块茎类植物细胞培养中含有多种特殊的代谢产物，如黄酮类、皂苷、多糖、生物碱及香精等活性成分。利用植物细胞培养技术生产药物和活性成分已成为当代生物技术的一个重要领域，特别是培养人参、何首乌等药用植物细胞直接生产天然药物研究已成为热点。

3展望

利用现代细胞悬浮培养技术研究和获取植物代谢产物，能够克服传统上从天然植物中直接提取代谢产物存在的一些不足。目前尽管在悬浮培养调控培养基、植物生长调节剂、光质、诱导子等影响次生代谢物积累方面的研究已经取得了很大的进展，然而只有人参皂苷、紫草宁等少数植物悬浮细胞培养实现了商业化生产。其主要原因在于，高产而又稳定的细胞系难以筛选；植物细胞生长周期过长，污染和褐化问题难以彻底解决；植物细胞要求复杂，生物细胞反应器工艺难以满足工业化生产要求；植物细胞培养成本高，代谢产物含量不稳定，调控难度大。因此，利用植物细胞悬浮培养技术获取次生代谢物还有待系统和深入研究。

随着生物转化技术和基因工程技术的不断发展，植物细胞培养技术结合生物技术获取次生代谢物展现出诱人的发展前景。要实现植物细胞培养工业化，需要重点开展以下4个方面的研究：①获取和筛选高产、稳定的细胞系；②探索并掌握植物细胞次生代谢信号调控机制，合理、准确地调控悬浮细胞生长和代谢；③改善植物生物反应器的工艺和技术，提供植物细胞培养的最适环境；④利用基因工程技术，对次生代谢中的关键酶基因进行修饰和改造，提高次生代谢物的产量。