不同温度对HE染色效果的影响

王庆容+徐晓舒+夏浪+杨秀荣

摘要： 取草鱼的肾组织、肝組织、肠组织，选择25、35、45 ℃这3种不同温度进行HE染色，以观察不同温度条件下的染色效果。结果表明，在35 ℃温度时所染的装片脱蜡较为彻底，染色效果很明显，细胞核与细胞质以及细胞之间的间隙可以清晰看到；而在25、45 ℃温度条件下染色效果则不明显。

关键词： 草鱼；HE染色；组织切片；最适温度；染色效果

中图分类号： S917 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0168-02

HE染色即苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining），是石蜡切片技术里常用的染色法之一 。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法[1]。苏木精可以将组织的嗜碱性结构（如核糖体、细胞核及细胞质中的核糖核酸等）染成蓝紫色，伊红可以将组织的嗜酸性结构（如细胞内及细胞间的蛋白质，包括路易体、酒精小体以及细胞质的大部分）染成粉红色，使整个细胞组织的形态清晰可见[2]。组织切片方法是教学、科研、病理检验工作中非常常用的一种试验方法，HE染色则是在制作切片的过程中最常用的染色方法[3]。

在实际试验操作过程中并不是每一张切片的质量都会出现预期的效果，而各种因素都会对切片的质量产生影响[4]。因此，制备一张质量好的切片，考虑的因素必须是多方面的，而温度的影响则是不可忽视的因素之一。

本试验选择外观正常、生长状况良好、体表无明显病变的草鱼，处死后取其肾、肝、肠分别进行组织学切片，选择25、35、45 ℃等不同的温度处理，观察在不同温度条件下的染色效果，以期找出HE染色的最适温度，为组织切片的染色技术提供一定帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

草鱼的肾、肝、肠组织切片。

1.1.2 试剂配制

常用于组织学切片制作的试剂有Bouin氏液（苦味酸75 mL、40%甲醛25 mL、冰醋酸5 mL）、粘合剂（鸡蛋清）、清洗液（重铬酸钾80 g、水1 000 mL、粗制浓硫酸120 mL）、乙醇（分别配制了70%、80%、90%、95%、100% 5种浓度）、1/2二甲苯（乙醇和二甲苯按1 ∶ 1比例配制）、氨水（1%）、酸水（1%）、0.2%苏木精染色液（苏木精6 g、无水乙醇100 mL、硫酸铝钾150 g、蒸馏水2 000 mL、碘酸钠1.2 g、冰醋酸120 mL、甘油900 mL）、0.5%～1.0%伊红染色液（95%乙醇配制）等。

1.1.3 试验仪器

本试验所用的仪器主要有精密电子天平 （AUY）、电热鼓风干燥箱（101-5型）、包埋机（徕卡YB-6LF）、轮转式切片机（徕卡RM2016）、摊片机（徕卡HI1210）等。

1.2 试验方法

试验的主要步骤如下：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、展片、染色、封片、镜检观察，详细步骤参考唐从国等的方法[5]。

2 结果与分析

2.1 不同温度条件下草鱼肾组织的HE染色效果

用显微镜观察3种温度条件下进行的HE染色，可以明显发现，在25 ℃时，由于温度较低，组织之间的蜡块没有完全脱掉，细胞核模模糊糊，不呈蓝色，颜色比较暗沉，不清晰，染色效果不明显（图1-a）；在35 ℃时，可以清晰地看到细胞间的界限，细胞核呈蓝色，其他部分呈红色或者粉红色，细胞排列紧密、 规则，染色效果很明显（图1-b）；45 ℃时染色效果比35 ℃的差，可以看到细胞界限，但是部分组织或者细胞核破裂，细胞核着色不明显或发灰（图1-c）。以上结果显示，对于草鱼的肾脏组织，在35 ℃左右的温度条件下染色效果较好。

2.2 不同温度条件下草鱼肝组织的HE染色效果

用显微镜观察不同温度条件下肝组织的切片，可以发现，在25 ℃时，肝组织中有很多蜡块没有脱掉，细胞核模糊，但形态依稀可见，细胞界限不清晰，细胞核能被染成蓝色，但是染色效果不明显（图2-a）；在35 ℃时，可以很清晰地看到肝细胞呈卵圆形，细胞核大而圆，且被染成蓝色，周围的组织也被染成粉红色或者红色，细胞界限清晰，染色效果较好（图2-b）；在45 ℃时，可以发现细胞之间的界限比较模糊，隐约可以看到细胞核被染成淡蓝色，少数组织染色不均，染色效果较35 ℃时稍差（图2-c）。以上结果显示，对于草鱼的肝脏组织，在35 ℃左右的温度条件下染色效果较好。

2.3 不同温度条件下草鱼肠组织的HE染色效果

用显微镜观察不同温度条件下的草鱼肠组织切片，可以发现，在25 ℃时，跟肾组织和肝组织切片一样，组织块之间的蜡没脱完全， 可以隐约看到肠绒毛，细胞界限不清晰，细胞核

染色较明显（图3-a）；在35 ℃时，可以看出肠组织结构完整，肠壁肌肉层均可清晰看到，肠细胞界限清晰，细胞排列紧密、规则，肠绒毛排列整齐、清晰，细胞核被染成蓝色，周围其他组织被染成粉红色（图3-b）；在45 ℃时，可以发现组织之间的蜡块被脱掉，但是细胞核由于受到高温，着色不明显，且组织之间出现裂痕（图3-c）。以上结果显示，对于草鱼的肠组织，在35 ℃左右的温度条件下染色效果较好。

3 讨论与结论

影响组织切片HE染色效果的因素很多，温度是较敏感的因素之一。要做好一张HE组织切片，须注意许多细节问题。取材时要注意整个组织的形态特点，组织块大小适宜、厚薄均匀、形状规则，一般大小为3～5 mm，夹取组织时不能用力挤压，避免机械损伤[6]。在制作组织切片的过程中，温度对染色效果的影响比较明显，温度过高或过低都会对结果产生直接影响。当温度过低时，二甲苯的脱蜡达不到预期的效果，组织内蜡太厚，不仅不利于细胞核以及胞浆着色，而且还不利于观察。当温度过高时，脱蜡或许能达到目的，但是高温也会对装片产生很多影响，如着色不明显、发灰等。在制作切片的过程中，低温时需要在脱蜡这一环节延长时间，这样就不能在有效的时间内制作出一张令人满意的装片，不仅浪费时间，而且还浪费试验材料。因此，本研究采用恒温箱，选取3种不同温度进行试验，验证了35 ℃左右为较合适的染色温度，在一定程度上节约了时间和试验材料。endprint

当然，温度并不是影响组织切片染色的唯一因素，染色前期的很多试验步骤对染色的影响也很大，包括取材、固定、浸蜡、烤片等步骤。如果固定不及时、不充分会造成细胞着色差或者发灰、组织结构模糊不清等。浸蜡、烤片这方面的因素容易被忽视，很多情况下细胞核发灰都与其相关，如果浸蜡、烤片温度过高，就会造成组织收缩变脆、细胞核染色不明显或发灰等。一些试剂（苏木精、伊红等）在染色過程也会对试验结果产生影响。

在25 ℃温度条件下，装片的细胞核、细胞质着色不明显，细胞核模糊不清，细胞界限不清晰，是因为组织块脱蜡不彻底。组织块在二甲苯中脱蜡需要合适的温度，温度过低，将导致脱蜡不彻底。在35 ℃温度条件下，装片的细胞核、细胞质着色很明显，细胞核被染成蓝紫色或蓝色，细胞质呈红色或者粉红色，细胞界限清晰，脱蜡较为彻底，能达到试验的目的。在45 ℃温度条件下，装片的细胞核、细胞质着色也比较明显，细胞核呈淡蓝色，细胞质呈红色或者粉红色，细胞界限可以大致看到模糊的轮廓。温度过高，会导致组织块出现裂痕，部分细胞核、细胞质破裂。

[JP+1]综上所述，在组织切片时，夏天温度高，在常温下染色可以达到目的，但是冬季温度低，应该在恒温箱内染色，且最理想的HE染色的温度应该控制在32～37 ℃之间。温度低了，组织块之间脱蜡就不完全，引起细胞核模糊不清，染色着色不明显，并且细胞之间的界限也不清晰；温度高了又会使得细胞破裂，组织结构之间出现裂痕，细胞核着色不明显或发灰。

参考文献：

[1] 田玉旺，李 琳，朱红艳，等. 常规HE染色易出现的问题、原因及解决方法[J]. 诊断病理学杂志，2008，15（6）：500-502.

[2] 郭 群，张品南. HE染色切片质量欠佳的原因及处理[J]. 中华今日医学杂志，2003（24）：52-53.

[3]王 华，周孝琼. 病理组织切片中常见问题及解决方法[J]. 实验科学与技术，2010，8（5）：38-40.

[4]郑玉琴，李 丽，王毅训，等. 制作微小组织切片的技术探讨[J]. 农垦医学，2008，30（2）：154-155.

[5]唐从国，郭周庆. 如何做好一张HE染色切片[J]. 中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（4）：428-429

[6]范小莉，胥维勇，杨 群. HE染色不良的分析与应对方法[J]. 临床与实验病理学杂志，2014，30（7）：805-807.endprint