猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP诊断方法的建立及耐药性调查

余波+杨莉+史开志+任荣清+徐景峨+杨粤黔

摘要： 为建立快速诊断猪傳染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）的方法和耐药情况，根据GenBank中的APP apxIVA基因，设计合成2对引物，通过环介导等温扩增技术（LAMP）扩增条件的优化，建立了APP LAMP诊断方法，同时对分离到的APP进行耐药性分析。结果显示，建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为2 pg/μL，对猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性，扩增反应30 min内完成，结果肉眼可见。分离得到的31株APP，耐药性较强。结果表明，建立的方法可满足基层现场快速检测需要，对分离得到的31株APP耐药性分析表明，APP耐药性较严重。

关键词： 传染性胸膜肺炎放线杆菌；apxIVA基因；环介导等温扩增；耐药性分析

中图分类号： S858.285.1+2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0165-03

猪传染性胸膜肺炎是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起以纤维性肺炎为主要特征的猪呼吸道疾病[1]。急性发病时，猪死亡率较高，出现呼吸严重困难，体温升高，食欲减退，剖检可见肺部与胸膜粘连；慢性发病时，猪死亡率较低，但生长缓慢，饲料转化率低。该病自1987年在我国被发现以来，贵州省各地报道较多，给养猪业造成严重的经济损失[2-4]。近年来，由于抗生素的滥用，APP耐药性日益严重[5-7]。为对APP进行现场快速诊断以及了解其耐药情况，根据GenBank中的APP apxIVA基因，设计合成2对引物，通过环介导等温扩增技术（LAMP）的扩增条件的优化，建立了APP LAMP诊断方法。同时，对分离的APP进行耐药性分析，为防治APP提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 细菌

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型、猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌由贵州畜禽重大疫病防制重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂

环介导等温扩增法DNA扩增试剂盒、环介导等温扩增法荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；猪传染性胸膜肺炎放线杆菌PCR试剂盒由贵州省畜禽重大疫病防制重点实验室研制；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中的APP 1～15型apxIVA基因序列，应用在线PrimerExplorer 4.0软件设计4条特异性引物，包括外引物和内引物（F3、B3、FIP、BIP）。引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。引物序号如下：

F3：5′-TGGAGCTCCTCGATCTCAAG-3′；B3：5′-GCCCCACAATGACGTGTAC-3′；

FIP：5′-GCAACGGTCACCAGACTCCCGACAACGGAGTGACCTGTC-3′；

BIP：5′-AGAGCAGCACCCTGTAACGTTTACGCTTCTGCATTTTCCCG-3′。

1.2.2 细菌核酸的提取

（1）临床样品：取1.0 g病猪肺脏、淋巴结加入2 mL 0.1 mol/L PBS 研磨后，反复冻融3次，5 000 r/min 离心5 min，取上清液用细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。

（2）细菌样品：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.3 LAMP扩增条件的优化

LAMP扩增条件的优化主要包括扩增温度（分别为60、65、70 ℃），扩增时间（分别为15、30、45 min），F3、B3引物浓度（分别为5、10、20 μmol/L），FIP、BIP引物浓度（分别为10、20、40 μmol/L），Bst DNA聚合酶用量（分别为0.5、1.0、2.0 U）。

LAMP反应在25 μL反应体系中进行，引物F3、B3各2 μL，引物FIP、BIP 4 μL，Bst DNA聚合酶1 μL（0.5、1.0、2.0 U），LAMP反应缓冲液12.5 μL，模板1.0 μL，加入环介导等温扩增法荧光检测试剂盒的荧光显色液1.0 μL，用ddH2O补足至25.0 μL。扩增产物于紫外光下进行观察。

1.2.4 敏感性试验

将提取的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌Ⅰ型核酸用核酸蛋白仪测定浓度后，经10倍系列稀释用于LAMP、PCR反应，以确定建立的LAMP诊断方法的敏感性。PCR试剂盒敏感性试验参照文献[8]进行。

1.2.5 特异性试验

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型、猪源大肠杆菌、猪源沙门氏菌、猪源支原体、副猪嗜血杆菌、猪源多杀性巴氏杆菌DNA为模板分别进行LAMP反应，以确定建立的LAMP诊断方法的特异性。

1.2.6 重复性试验

应用建立的LAMP诊断方法，重复检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌1～15型3次以检验结果的可靠性。

1.2.7 建立的LAMP对临床样品的检测

2014年3月至2016年3月，在贵州省贵阳市、安顺市、遵义市、凯里市、兴义市、铜仁市、瓮安县 15个规模场和48家养殖户236份疑似病猪样品采用建立的LAMP诊断方法进行检测，同时应用研制的PCR诊断试剂盒进行检测。

1.2.8 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌耐药性分析

2014年3月至2016年3月，对在贵州省贵阳市、安顺市、遵义市、凯里市、兴义市、铜仁市、瓮安县的15个规模场和48家养殖户分离得到的APP采用药敏纸片法检测分离菌对18种抗生素药物的敏感性，药敏试纸片包括青霉素、氨苄西林、头孢噻吩、头孢拉定、头孢唑林、链霉素、庆大霉素、氟哌酸、恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素、红霉素、利福平、泰乐菌素、卡那霉素、土霉素、林可霉素、磺胺二甲嘧啶钠。将分离纯化的细菌涂布在含烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的巧克力琼脂培养基上，置于5% CO2 37 ℃培养箱，24 h后观察并测量抑菌圈直径，判定标准参考杭州微生物试剂有限公司说明书。endprint